脲酶的测定方法

1、一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。1、试剂配制：（1） pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。（2） 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。（3） 次氯酸钠溶液：用水稀释

2、制剂至活性氯的浓度为0.9，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。（4） 10尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。（5） N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。2、操作步骤称取5土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(6.7),仔细混匀。在37恒温箱中培养24。然后用热至38的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL

3、苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20后,将混合物稀释至刻度,在波长578处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。3、结果计算以24小时后1g土壤中NH3N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）UreaVn/m式中：a为由标准曲线求得的NH3N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50

4、mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。补充：1) 1h内在（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。2) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照3)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。过氧化氢酶测定(容量法)过氧化氢酶也叫接触酶，能促进过氧化氢对各种化合物的氧化。几乎在所有的生物体内部有过氧化氢酶，在某些细菌里，其数量约为细胞干重的1。土壤的过氧化氢酶活性，与土壤呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映了土壤微生物学过程的强度。原理过氧化氢酶过氧

5、化氢酶的测定有测压法和滴定法。测压法是测定过氧化氢分解时析出的氧量(反应式为： H2O2+H2O O2+H2O，方法简单，但准确性较差。后者则是定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量，反应式为 2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2，此法测定结果较好。试剂(1) 0.3% H2O2：按1：100将30的H2O2用水稀释。(2) 3N H2SO4（也就是1.5mol/l H2SO4）：以配1000ml为例，需要的浓硫酸的体积为1.5*98.08/1.83=80.39ml，可以取80ml。KMnO4的分子量=158.026,当量=31.605.高锰酸钾水溶液受

6、到水中还原物和杂质以及受日光直射等影响能分解析出棕色的含水的二氧化锰沉淀，而有浓度的改变。因此在配制其标准溶液时必须使用棕色瓶盛装，以防日光直射作用.配制后并应放置一段时间，待与水中还原物完全作用后，滤去沉淀，然后进行标定，才能得到基本稳定不易变化的标准溶液。(3) 0.1N KMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161克，溶于l升无CO2蒸馏水（沸水）中，溶解后,在暗处放置一周, 然后用虹吸管将上部澄清溶液移于棕色瓶中(或用玻璃棉滤过)保存，以备标定.注：C(1/5 KMnO4)=0.1mol/l表示的就是0.1N KMnO4溶液。0.1N KMnO4溶液标定（GB/T601-2002）称取

7、0.2g（准至0.0001g）于105110烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液c（1/5 KMnO4）=0.1mol/l滴定，近终点时加热至65，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验（不加草酸钠，其他一样）。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c（1/5KMnO4）=m*1000/（V1-V2）*M 式中 c（1/5KMnO4）高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L； m草酸钠之质量，g； V1滴定草酸钠消耗的高锰酸钾溶液之用量，mL； V2空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；M草酸钠的摩尔质量的数值,单位为（g/mol）， M(1/2N

8、a2C2O4)=66.999 或者c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.067000.06700与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=0.1mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。操作步骤：（1）取2.0 g土，置于100mL（或150ml）三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3H2O2溶液。（B）（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3过氧化氢溶液，而不加土样。（A）（3）将三角瓶放在往返式振荡机上120r/min振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1N KMn

9、O4滴定至淡粉红色终点。结果计算用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。以20min后1g土壤消耗的0.1N KMnO4溶液的毫升数表示（以20min后1g土壤中的过氧化氢的毫克数表示？）。土壤过氧化氢酶活性 =（A-B）T/dwt式中，T为高锰酸钾滴定度的校正值。 dwt烘干土质量（g）滴定度：分析化学 专属名词单 位：g/ml、mg/ml表示符号：Ts：每毫升标准溶液中所含滴定剂（溶质）的克数。例如：THCl0.001012g/ml的HCl溶液，表示每毫升此溶液含有0.001012g纯HCl。Ts/x：指每毫升

10、标准溶液相当于的待测组分的质量。S：代表滴定剂（标准溶液）的化学式。 X：代表被测物的化学式。例如：THCl/Na2CO30.005316g/ml HCl溶液，表示每毫升此HCl 溶液相当于0.005316g Na2CO3。 例：用T（EDTA/CaO）=0.5mg/ml的EDTA标准溶液滴定含钙离子的待测溶液，消耗了5ml,则待测溶液中共有CaO 2.5mg。 计算方法： T=n*M/V或T=C*M土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶

11、解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876g Na2HPO42H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象

12、，则应弃之，重新配制。 3）3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。三、操作步骤（1）标准曲线绘制分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂1mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长508nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定称取1 g土壤，置于50mL三角瓶

13、中，注入3 ml 8%蔗糖溶液，1 ml pH 5.5磷酸缓冲液和200L甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加1ml DNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至7 ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。四、结果计算：蔗糖酶活性以24h，1g干土

14、生成葡萄糖毫克数表示。蔗糖酶活性=（a样品a无土a无基质）nma样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；土壤多酚氧化酶活力的测定试剂配制 （1） 1%邻苯三酚溶液 （2） 乙醚（3） 0.5N盐酸 （4） 重铬酸钾标准溶液0.75g重铬酸钾溶于1升0.5N HCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)(5) pH45柠檬酸磷酸缓冲液。1. 标准曲线的绘制：取重铬酸钾标准溶液，用0.5N HCI稀释成各种不同浓度。定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 2. 投作步骤 取1g土样(过0.25mm筛)，置

15、于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。取出后加4mlpH 45柠檬酸磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片。为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。 为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正。没食子酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。在无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。 3活性表示 紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子

16、素的毫克数表示。 纤维素酶活性测定一、试剂：1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45下搅拌2 h，此溶液在4下可存放7天。3）还原糖试剂：试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。 试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2

17、H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50去离子水，冷却后稀释至1 L。4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。二、仪器设备恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶三、操作步骤取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于

18、20 ml试管中，加 2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100水浴中加热15 min 后，立即至于20水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白：无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。四、结果计算 土壤纤维素酶活性（gg-1(24 h)-1）(C*V*f)/ dwt式中C为样品的葡萄糖含量（gml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；dwt为烘干土壤质量（g）五、注意事项（1）此方法较适用于林地土壤，耕