固定化酶与固定化细胞（课堂PPT）

1、1本章讲授本章讲授固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基本技术和原理；本技术和原理；细胞固定化的基本技术和原理；细胞固定化的基本技术和原理；简要介绍固定化酶基本性质的影响及辅因简要介绍固定化酶基本性质的影响及辅因子的固定化方法和辅酶的再生体系。子的固定化方法和辅酶的再生体系。 231.1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。机溶剂对其有影响）。2.2.不能回收，使用成本高。不能回收，使用成本高。3.3.酶在游离体系中更容易自水解酶在游离体

2、系中更容易自水解4.4.分离纯化困难，也使产物中混杂酶蛋白分离纯化困难，也使产物中混杂酶蛋白 游离酶的缺点：游离酶的缺点：4 固定化酶固定化酶（定义）：用物理或化学手段定位在限（定义）：用物理或化学手段定位在限定的空间区域，并使其保持定的空间区域，并使其保持催化活性催化活性，可重复利，可重复利用的酶用的酶。（。（19711971年在美国召开的第一届国际酶工程会议）年在美国召开的第一届国际酶工程会议） 固定化细胞固定化细胞（定义）：将具有一定（定义）：将具有一定生理功能生理功能的生的生物细胞物细胞（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），用一定的用一定的方法

3、将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。的一门技术。 固定化细胞意义固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂，：用完整的细胞作为生物催化剂，以充分有效地利用生物细胞内的特定以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶酶或多酶系系统。统。 5优点优点省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产成本成本降到最低程度；降到最低程度；可以利用细胞的可以利用细胞的多酶系统多酶系统直接生产有价值直接生产有价值的产物。的产物。6第一节第一节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化一、一、固定化酶固定化酶和细胞的定义及特点和细胞的定义及特

4、点二、固定化二、固定化方法方法三三 细胞的固定化方法细胞的固定化方法四四 原生质体的固定化方法原生质体的固定化方法7一、固定化酶和细胞的定义及特点一、固定化酶和细胞的定义及特点 1.1.固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme) 通过化学或物理的手段将酶定位于限通过化学或物理的手段将酶定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。利用。 8什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术9酶固定化方法酶固定化方法要

5、求要求不破坏不破坏酶活性中心的构象酶活性中心的构象：酶的固定化不能破坏：酶的固定化不能破坏酶活性中心的构象，尽量防止活性部位的氨基酸酶活性中心的构象，尽量防止活性部位的氨基酸残基受到影响；残基受到影响；载体要求载体要求：a.a.固定化的载体应与酶结合较为牢固。固定化的载体应与酶结合较为牢固。B.B.载体不能与底物、产物等发生化学反应。载体不能与底物、产物等发生化学反应。C.C.载体必须有一定的机械强度，防止因机械搅拌而载体必须有一定的机械强度，防止因机械搅拌而破碎。破碎。位阻位阻应该较小：尽可能不妨碍酶与底物的接近。应该较小：尽可能不妨碍酶与底物的接近。成本成本低：酶固定化的成本要尽可能的低。

6、低：酶固定化的成本要尽可能的低。 10优点优点：(1)(1)可提高稳定性。可提高稳定性。(2)(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点缺点：(1)(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)(2)酶活性下降。酶活性下降。11 2. 2. 固定化细胞固定化细胞（immobilized cellimmobilized cell） 固定在载体上并在一定空间范围内进行固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。12优越性优越性：(1)(1)降低成本，省去酶的分

7、离纯化工作降低成本，省去酶的分离纯化工作; ;(2)(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。完成部分代谢过程。局限性局限性：(1)(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。产物。(2)(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。作用。133.3.固定化原生质体固定化原生质体 意义意义：(1)(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。胞内产物的

8、分泌。(2)(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高由于载体的保护作用，稳定性提高。14 二、固定化方法二、固定化方法固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法（一）酶的固定化方法吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型微囊型微囊型离子交离子交换吸附换吸附物理物理吸附法吸附法 15依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。上。1.1.吸附法（吸附法（adsorptionadsorption

9、）16根据吸附剂的特点分根据吸附剂的特点分: : 1 1）物理吸附法（）物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion）作用力：作用力：氢键、疏水键氢键、疏水键常用载体常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。2 2）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding）作用力作用力：离子键离子键常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM- 纤维素纤维素17优点：优点：条件温

10、和，操作简条件温和，操作简便，酶活力损失少。便，酶活力损失少。缺点：缺点：结合力弱，易解吸结合力弱，易解吸附附。18 借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非必需侧链基非必需侧链基团和载体的功团和载体的功能基团进行偶能基团进行偶联。联。2.2.共价偶联法共价偶联法（covalent binding covalent binding or covalent couplingor covalent coupling） 19 1 1）载体：亲水载体优于疏水载体）载体：亲水载体优于疏水载体 如如: :天然高分子衍生物天然高分子衍生物: : 纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和

11、性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物： 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙202 2）偶联方法：）偶联方法：偶联成功与否取决于：偶联成功与否取决于：载体：载体：功能基团：芳香氨基，羧基，功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。羧甲基等。酶分子酶分子: :侧链非必需基团：羧基，巯侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。基，羟基，酚基，咪唑基。21常用的偶联反应有：重氮化法、叠常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。氮法、溴化氰法、烷基化法等。22优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻易酶与载体结

12、合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。脱落，可连续使用。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶的反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。空间构象而影响酶的催化活性。 233.3.交联法交联法（crosslinkingcrosslinking） 借助双功能试剂使酶分子之间发生交借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。联的固定化方法。双功能试剂双功能试剂：常用的是常用的是戊二醛戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H24 戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与个醛基，均可与酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应, ,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。 此法与共价偶联法利

13、用的均是共价键，此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：不同之处：交联法交联法不使用载体不使用载体。 25 交联反应既能发生在分子间，也可交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。发生在分子内。 酶酶浓度低浓度低时，交联发生在时，交联发生在分子内分子内，酶，酶仍保持溶解状态。仍保持溶解状态。 酶酶浓度高浓度高时，交联发生在时，交联发生在分子间分子间，酶，酶变为不溶态。变为不溶态。26缺点：缺点：(1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。被交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便

14、。带来不便。 274. 4. 包埋法包埋法（entrapmententrapment） 将酶用物理的方法将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚包埋在各种载体（高聚物）内。分为：物）内。分为：网格型网格型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。分子凝胶细微网格中。微囊型微囊型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子半透膜中。分子半透膜中。281）网格型包埋法网格型包埋法（gel (lattic) entrapmentgel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法又称凝胶包埋法凝胶凝胶包埋条件包埋条件酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉

15、菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应部分失活部分失活 高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点29海藻酸钙凝胶海藻酸钙凝胶包埋法：包埋法： 滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E (or cell) CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶角叉菜胶包埋法：包埋法： 滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E (or cell) KCl 溶液中溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶包埋法：包埋法： APAcr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED302 2）微囊型包埋法）微囊型

16、包埋法（microencapsulationmicroencapsulation）又称又称半透膜半透膜包埋法包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内孔膜内 。 半透膜半透膜：直径几十微米到几百微米，：直径几十微米到几百微米，厚约厚约25nm25nm。 半透膜半透膜孔径孔径 80%80%活性。活性。51 （三）酶的最适温度三）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。度也上升（有例外）。 （四）酶的最适（四）酶的最适pHpH 带负电荷载体带负电荷载体

17、 ：最适：最适pH pH 向碱性偏移。向碱性偏移。 带正电荷载体带正电荷载体 ：最适：最适pH pH 向酸性偏移。向酸性偏移。5253 固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电随载体的带电性能变化。性能变化。 固定化载体与底物电荷相反固定化载体与底物电荷相反, ,固定化酶的固定化酶的表观表观K Km m值降低。值降低。 固定化载体与底物电荷相同固定化载体与底物电荷相同, ,固定化酶的固定化酶的表观表观K Km m值显著增加。值显著增加。（五）酶的动力学特征（五）酶的动力学特征54 与自然酶基本相同。但大分子底与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一

18、性物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。发生改变。（六）酶的作用专一性（六）酶的作用专一性 55 与固定化酶相比，固定化细胞的情与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。况比较复杂。 （1 1）有活性升高的现象。）有活性升高的现象。（2 2）稳定性的增加）稳定性的增加 。（3 3）最适温度和最适）最适温度和最适pHpH常保持不变。常保持不变。二、固定化细胞的性质二、固定化细胞的性质 56 ( (一一) )酶酶( (细胞细胞) )的活力的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。

19、化酶。 ( (二二) ) 蛋白总量蛋白总量 1.1.双辛可宁酸法双辛可宁酸法(BCA(BCA法法) ) 2. 2.考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 三、固定化酶（细胞）的评价指标三、固定化酶（细胞）的评价指标 57 ( (三三) )偶联率及相对活力偶联率及相对活力 偶联率偶联率=(=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/)/加入蛋白活力加入蛋白活力100%100%活力回收活力回收= =固定化酶总活力固定化酶总活力/ /加入酶的总活力加入酶的总活力100%100%相对活力相对活力= =固定化酶总活力固定化酶总活力/ (/ (加入酶的总活加入酶的总活力力- -上清液中未偶联酶活力上

20、清液中未偶联酶活力) )100%100%58 ( (四四) )半衰期半衰期 在连续测定条件下，固定化酶在连续测定条件下，固定化酶( (细胞细胞) )的活力下降为最初活力一半所经历的连续的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以工作时间，以t t1/21/2表示。表示。 是衡量稳定性的一项重要指标。是衡量稳定性的一项重要指标。59不同固定化方法的比较不同固定化方法的比较carriersRecovery of enzyme activity(%) Agar 54.0po1yacrvlamldel5.24Gelatin40.77carragheenan69.13Glutaraldehyde06

21、0第三节第三节 固定化酶与固定化细胞的应用固定化酶与固定化细胞的应用 一、在一、在工业生产上工业生产上的应用的应用 二、固定化酶在二、固定化酶在医学上医学上的应用的应用 三、在三、在分析检测分析检测中的应用中的应用61乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D Ala 一、在工业生产上的应用一、在工业生产上的应用 1. 氨基酰化酶（氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一种工业化生产的固定化酶世界上第一种工业化生产的固定化酶62泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化固定化酶柱子酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-

22、Ala63 2.2.葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 世界上生产规模世界上生产规模最大，应用最为成功最大，应用最为成功的一种固定化酶。的一种固定化酶。64二、固定化酶在医学上的应用二、固定化酶在医学上的应用 1. 消血栓：消血栓：n纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。反应，无法长期使用。n酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。能自由进出。652. 2. 人工肾：

23、人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。和微胶囊活性炭组成人工肾。66671.1.酶传感器酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。固定化酶和电化学传感器的结合。 优点：优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；电极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定能够直接在复杂试样中进行测定。 三、在分析检测中的应用三、在分析检测中的应用68

24、69 19671967年年UpdikeUpdike等采用酶的固定化等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器世界上第一个生物传感器葡萄糖葡萄糖氧化酶电极氧化酶电极。70 葡萄糖酶电极 酶电极示意图D葡萄糖葡萄糖O2 D葡萄糖酸葡萄糖酸1，5内酯内酯H2O2半透膜酶胶层感应电极71GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根据反应中消耗的根据反应中消耗的O O2 2

25、、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，的量，可以用氧电极、可以用氧电极、pHpH电极和电极和H H2 2O O2 2电极来测定葡萄糖的含量。电极来测定葡萄糖的含量。 72继酶传感器（继酶传感器（enzyme sensorenzyme sensor）后，又出现：）后，又出现： 细胞器传感器（细胞器传感器（cell organelle sensorcell organelle sensor） 组织传感器（组织传感器（tissue sensortissue sensor） 微生物传感器（微生物传感器（microbe sensormicrobe sensor） 免疫传感器（

26、免疫传感器（immunosensorimmunosensor）731）酶传感器的原理）酶传感器的原理 生物传感器生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。析仪器。7475生物识别元件生物识别元件(Biological recognition element)(Biological recognition element) 是酶、抗原是酶、抗原( (体体) )、细胞器、组织、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的化后形

27、成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。物质有选择性的分子识别能力。76 换能器换能器(Transducer)(Transducer) 将识别元件上进行的生化反应中将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系比例关系。7778酶传感器工作原理示意图酶传感器工作原理示意图酶传感器酶传感器主要由主要由固定化酶膜和变换器固定化酶膜和变换器组成：组成：固定化酶膜：固定化酶膜：选择性地选择性地“识别识别”并催化被检测物质并催化被检测物质发生化学反应；发生化学反应；变换器：

28、变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。信号，通过仪表显示出来。 79802）酶传感器的应用）酶传感器的应用 水质监测水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。可干扰其测定。 从马铃薯中提纯、经吸附交联得到从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物器，可检测大多数酚类化合物。81德国研发的环境废水德国研发的环境废水BODBOD分析仪分析仪82医疗方面医疗方面葡萄糖传感器和血糖测定仪葡萄糖传感器和血糖测

29、定仪 用葡萄糖氧化酶（用葡萄糖氧化酶（glucose glucose oxidase,GODoxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。可测定血液中葡萄糖浓度。 83手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析仪分析仪84SBA-50SBA-50型单电极生物传感分析仪型单电极生物传感分析仪85SBA-70型血糖乳酸自动分析仪型血糖乳酸自动分析仪86n食品鲜度食品鲜度鱼鲜度传感器鱼鲜度传感器 在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内度的测定。鱼死后体内ATPATP经酶解依次形成经酶解依次形成ADPADP、AMPAMP、IMPIMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用鲜度可用K K值表示：值表示：K=K=肌苷肌苷+ +次黄嘌呤次黄嘌呤/