荧光原位杂交综述

1、荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。关键词：荧光原位杂交；1 .发展荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization,FISH是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA1。1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA或28sRNA被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术（microautoradiography

2、,MAR）检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测2。2 .原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系。原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。只有这样染色体D

3、NA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理1。3 .关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。20世纪80年代后期，非放射性DNA荧光标记技术的发展解决了上述问题，这些标记将高灵敏度与高分辨率

4、结合起来，适用于原位杂交。现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，因此有可能将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每种杂交信号，从而测定出各探针序列的相对位置。为了得到最高的灵敏度，探针的标记需要尽可能大一些。在过去这就意味着探针必须是相当长的DNA分子，通常是至少40kb的克隆片段。现在已发展出将较短的DNA分子进行标记的技术，对长度的要求已不那么重要。构建物理学图谱时，克隆的DNA片段可被简单地看作另一种类型的标记物，但在实际应用，由于克隆的DNA片段确定了DNA序列，将其作为标记应用则具有另一层含义。因此，克隆间位置关系的确定提供了基因组图谱与其DNA序列间的直接联系。如果探针是长的

5、DNA片段，至少对于高等真核生物，就可能产生这样一个问题：探针中可能含有一些重复的DNA序列，因此探针可能与染色体上多个位点杂交，探针在使用前要与来自被研究组织的未标记DNA混合。这种DNA可以是总的核DNA（即代表了全基因组），但如果使用富集重复序列的片段更好。加入未标记DNA的目的在于与探针中的重复序列结合并将其封闭，使随后的原位杂交完全由单一序列驱动（Lichteretal.,1990）。这样非特异性杂交即可被减少或完全消除1。4 .荧光染料常用的荧光染料的DAPI在UV光激发下发出蓝色荧光卜FITG荧光素（蓝光下发出绿色荧光）以及罗丹明和德克萨斯红（绿光激发下产生红色荧光）。由于FIS

6、H的信号空间分辨率高。不同的DNA探针可以用不同的半抗原标。再用不同的荧光染料进行同时检测（复色FIAH,MulticolorFISH,Mc-FISH）而常用的荧光素有异硫氟酸荧光素（FIT。、竣基荧光素（FAM）、四氯-6-竣基荧光素（TET）、六氯-6-甲基荧光素（HEX、四甲基异硫氟酸盐罗丹明（TRIT。、呷咪二竣氟（Cy3,Cy5等，这些荧光素具有不同的激发和吸收波长。需要选择两种以上的探针同时杂交时，要对几种探针分别标记不同的荧光素3。5 .实验过程5.1 核酸探针的设计和标记根据来源和性质将核算分子探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针以及人工合成的寡核甘酸探针等。其中

7、人工合成的寡核甘酸探针具有特异性强、容易获得、杂交迅速等优点，故被广泛采用。寡核甘酸探针是根据已知靶序列设计的，一般应遵循如下设计原则：1）探针长度一般为10-50bp,越短则特异性越弱，太长则延长杂交时间；2）（G十C）百分比应在40%-60线，否则减弱特异性；3）探针内部不要有互补序列，以免形成“发夹”结构；4）避免同一碱基连续重复出现；5）与非靶序列区域同源性70%o设计或选定的寡核甘酸探针可以用DNA合成仪合成，然后用荧光素进行标记。5.2 杂交样品的制备对收集的样品进行固定和预处理（变性），使细胞形态基本不变，并且强细胞壁的通透性，保证探针顺利进人细胞与DNA或RNA杂交。主要过程是

8、将组织玻片在变性液内加热浸泡，然后乙醇梯度脱水（依次置于-20C的70%乙酉1、85%乙醇和100%乙醇中各3分钟进行梯度脱水，自然干燥），46c烤片2-5分钟，使组织内细胞染色体变性解开双链。5.3 探针变性FISH探针需要经过高温变性才能与变性后的染色体杂交并显现荧光，这是由于高温解链后的DNA探针才具备结合相应染色体的特性。探针混合物充分变性，双链完全解开，对于FISH实验的成功非常重要。5.4 探针复性探针变性后还需要复性，是指在低于变性温度但高于常温的环境中使解链的DNA双链稳定的反应过程。复性是关系FISH实验成败的重要步骤，不完全复性或过度复性均可能会导致变性无效从而使探针失去作

9、用*所有设计到探针的操作步骤均需要避光操作。*关于探针的变性和复性的温度及时间，应该更具探针的长度及性质选取，我查阅的不同文章选用的温度时间都不太相同。一般探针变性温度731C5分钟，复性45-50C杂交前取出。5.5 探针于样本的杂交将变性后的探针混合物滴于玻片杂交区，立即加盖玻片，避免气泡，橡胶封边。玻片置于预热湿盒内，42c保温箱过夜杂交。5.6 玻片洗涤室温下将50%甲猷胺/2XSSC容液倒入三个分别标记为“1、”2、“3”的考普林瓶中。使用前将盛有溶液的考普林瓶置于461C水浴箱中至少30分钟，使溶液达到所需温度。分别将50ml2XSSC容液和2XSSC/0.1%NP-似液倒入考普林

10、瓶中，使用前将盛有溶液的考普林瓶置于461C水浴箱中至少30分钟,使溶液达到所需温度。*具体溶液配方我查到的许多文章上都有配方，以及一些实验细节，此处就未列出。5.7 观察暗处自然干燥；DAPI需要加复染液，置于荧光显微镜下观察摄像，保留结果。6 .认知随着标记技术和信号检测设备的不断改进及相关的细胞遗传学和分子生物学技术的发展，FISH技术得到迅速的发展。FISH技术逐渐形成了从单色到多色、从中期染色体到粗线期染色体再向DNA纤维的发展趋势，灵敏度和分辨率正在由mb向kb、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、大片段向小片段再向BAC/YA*方向不断提高。FISH技术与PCR.Southernblotting,RFLP,AFL暮生物技术相结合，产生了新的技术和方法，我认为也会在今后的各项科研领域展现其优越的性能。参考文献1维基百科，/wiki/%E8%8D%A7%E5%85%89%E5%8E%9F%E4%BD%8D%E6%9D%82%E4%BA%A42王继华，杨茹冰，李晶.荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展.哈尔滨师范大学自然科学学报.Vol22,No.5,20063夏铁骑.荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用.新乡学院报（自然科学版）.第26卷第2期2009年4月4丁小波.荧光原