质粒构建-protocol

1、一，引物设计：1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。2,在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。1,使用word排除目的片毕里含有的酶甲邛;，最后确定所使用的酶。首位20个碱基耒尾20个碱基的反向互补碱基2,设计引物：primer-up：保护碱基4个-上游酶切位点Primerowm保护碱基4个-下游酶切位点3,核对-送公司合成。4,对公司合成的引物离心，10000rpn5-10分钟、at4C,在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2。，再把上游引物和下游引物混在一起，at4C保存。二，PCR（P出目的片段）：（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：

2、1,摇菌过夜：15ml离<心管QmlLB菌液1ul2xPFUmix25ulPrimer1ul2dH2O23ul2,pcr:JPcr(50u反应体系2ul韩家淮实验室的菌液,Xul相应的抗生素-94c5min94c30secPcr温度体58c30SeC3333CyCleS系72cXminI72c5min（X是根据片段的长度设定，来计算，一般低于Tm值2C）3,跑胶、回收：（1）,配胶：500-1000bp/min,退火温度根据Tm值1%的琼脂糖胶：大块称0.6g的琼脂糖加入60ml的1XTAE煮沸3次I加入0.6ul的EB（待温度降到50-60C左右时）25分钟后，即可点样跑胶。（2）,跑

3、胶：130-150V、25-30分钟左右。（3）,紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4,做胶回收（天根TIANGEN於司的DNA屯化回收t剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，HutionBuffer预先在55-65C温箱中水浴，并且在加过EBB,放在37c温箱中2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloadingbuffer2ul、2dH2O6ul。三，酶切、链接:1,目的片段酶切：（37C酶切过夜或者4小时）<insert:上述胶回收产物35ul10xHbuffer（1.5x）7ul50ul的体系JddH2O6ul

4、酶11ul、酶21ul2,载体酶切：（37C酶切过夜或者4小时）Vector（1ug/ul）:2ul10xbuffer（1.5x）3ul20ul的体系JddH2O13ul酶11ul、酶21ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。3,酶切时，首先要核对一下酶的buffer,有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer,那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。4,连接：广2xRapidLigation6ulVector0.8ul12ul的体系"insert4.5ul（目的是为了多加点insert）T4DNALignase1ul四，转化:感受态细菌10ul质粒1

5、0ul90秒-一冰上2分钟、冰上20分钟-一热激：42C、力口1mlSOC（或者1mlLB）,37C、180rpm、45分钟。、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨茉）。、250rpm、过夜。五，质粒大抽：六，收菌：取过夜菌至50毫升离心管，离心：6000g、3-5分钟、4C。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。（倒置于草纸上使液体流尽）。七，重悬：每管加入8ml的RES-EF（RnaseA）,重悬细菌沉淀一充分Vortex或用枪头吹打沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3,裂解：每管加

6、入等量的LYS-EFbuffer,即8ml。轻轻上下颠倒离心管4-6次，（勿震！）室温放置5min,使细菌完全裂解，溶液透明，无团块或絮状物。注意：vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染4,平衡：滤芯插入柱子，将柱子驾于50ml离心管上（或者直接架于50ml离心管架上）：取15mlEQU-EFbuffer沿滤芯四周加入一充分平衡滤芯。注意：离心管内的液体不要浸没滤柱的头，所以要勤于倒弃滤液，在过滤平衡液的同时，进彳55、6步，防止滤芯干掉。5,中和：在等待EQU-EFbuffer滤完时，往裂解好的菌液中加入8mlNEU-EFbuffer,颠倒混匀

7、，冰上孵育5min。（不能vortex）6,离心、过滤：离心中和过的菌液：10000rpm、5-10min、at4C-质粒存在于上清中。（离心使沉淀更加紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助）：将上清吸入到平衡好的滤芯中，重力自流尽。7,洗一：过滤完毕后，吸取5ml的FIL-EFbuffer,沿滤芯四周加入（将粘在滤芯上的质粒洗下来）-过滤完后，将滤芯弃掉。8,洗二：往滤柱中加入35ml的ENDO-EFbuffer一去内毒素9,洗三：待滤完后再加入15ml的wash-EFbuffer一过滤。10,洗脱：取一支干净的15ml超速离心管，将滤完的柱子插入到离心管中，用高压条将二者绑好，往滤柱中加入5mlElu-EFbuffer.（Elu-EFbuffer预先放在50c的恒温箱中加热，可提高洗脱效率）11,沉淀：待Elu-EFbuffer滤完后，弃滤柱，往离心管中加入5ml的异丙醇（将质粒沉淀下来），混匀（充分vortex）,静止10min-10000rpm、30min、4C-弃上清。12,洗涤：加5ml的70%酒精（ETOH或用15ml三蒸水（高压过）+35ml的无水乙醇配制（在超净台进行），混匀（上下颠倒即可），离心：10000rpm>10min、常温。弃上清