蓝藻蛋白的分离与纯化

1、藻蓝蛋白的分离与纯化一、 实验目的和要求 1、 了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和 纯化的方法； 2、 掌握蛋白含量测定方法； 掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。 二、 实验原理 藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。 此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是 一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗 价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性 免疫功能有促进作用。另外，它还具有清除自由基的能力，可以 抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义

2、。 利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成 的正负离子可吸引水分子， 从而夺取蛋白质分子上的水化膜， 还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质 的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度 不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各 不相同研究表明可用 25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质， 55%(NH4)2SO4 沉淀藻蓝蛋白。 盐析出来的蛋白质， 需通过脱盐以 除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透 膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析

3、掉。 蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、 考马斯亮蓝法等） 本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的 ， 含量，考马斯亮蓝 G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质 通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由 465nm 变为 595nm，在 一定范围内，蛋白质的含量与 595nm 处吸光值成正比。 离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性 的羧甲基纤维素（CM-纤维素） ，阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨 基乙基纤维素（DEAE-纤维素） 。蛋白质的混合物与纤维素离子交 换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相 反电荷基团的静电引力。因此，被

4、吸附的蛋白质的洗脱通过改变 PH 或离子强度来实现， 与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层 析柱中被洗脱下来。 本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋 白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的 含量，然后使用 DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯 化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电 点尚无一致结论，但都在 3.4-4.8 之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白 的等电点为 4.3，在 PH6.5 磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择 DEAE-纤维素阴离子交换柱） 。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。 三、 试剂与仪器 1、 试剂 螺旋藻藻粉 0.01m

5、ol/L 磷酸盐缓冲液（PH6.5） 、标准蛋白（0.1mg/L） 、考马斯亮 蓝 G-250、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、 硫酸铵、透析袋、DEAE 纤维素、奈氏试剂 四、实验步骤 （一） 、藻蓝蛋白的提取及初步纯化 1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋 白。 具体操作：取螺旋藻粉 1g，加入 0.01mol/LPH6.5 的磷酸盐缓冲液 10mL，充分搅拌混匀。室温浸泡 30min-1h 后，在-20和 38之间 反复冻融数次（3-5 次） 。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入 10mL0.01mo

6、L/L PH6.5 的磷酸盐缓冲液， 混匀， 静止 30min， 4000r/min 离 心 20min ， 上 清 液 即 为 抽 提 得 到 的 藻 蓝 蛋 白 混 合 液 。 2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。 具体操作：取上清液，用 25%饱和度的硫酸铵 4 盐析 30min ，然 后 4000r/min 离心 20min，所得上清液用 55%饱和度的硫酸铵放入冰 箱盐析 30min，4000r/min 离心 20min，弃去上清液，离心收集得到 沉 淀 即 为 藻 蓝 蛋 白 。 3、透析去盐 得到的沉淀用 10mL0.01moL/Mlph6.5 的磷酸盐

7、缓冲液溶解，然后 将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为 10Kd）中在蒸馏水中透析以去除盐离子。每隔 1h 换一次透析液，换 3-4 次。 (二)藻蓝蛋白含量测定 1、制作标准曲线； 2、样品含量测定； 3、计算结果。 具体操作步骤如下： 取洁净干燥的试管若干，按表 1-1 比例配置标准蛋白溶液。原本标准 蛋白的浓度为 0.1mg/mL。 表 1-1 标准溶液配置 管号 标准蛋白（mL） 蒸馏水（mL） 1 0 1 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 6 1.0 0 混匀此 6 组试管中的标准蛋白溶液，分别加入 4mL 考马斯亮蓝 G-250，

8、摇匀(充分混匀)，室温放置 5min 后在 595nm 波长处别色，以 1 号试管调零点，得到 5 组标准蛋白溶液在 595nm 处的吸光值 A595。 以标准蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，以 A595 值为纵坐标作图，得到 的趋势线即标准曲线。将提取的藻蓝蛋白溶液 1mL 适当稀释（6-10 倍左右） ，再取 0.2mL，补充水到 1mL，同上进行比色操作，得到其 595nm 处的吸光值，通过标准曲线推算其含量。 （三）藻蓝蛋白纯度的测定 测定 A620 和 A280 值，纯度可用 A620/A280 来表示。 将上述稀释后的样品，用可见分光光度计，测定其在 620nm 波长处的吸光值 A

9、620；再将样品转出，装入石英比色皿，放入紫外分光 光度计， 测定其在 280nm 波长处的吸光值 A280。 由于藻蓝蛋白在 620nm 波长处有特征吸收峰，其纯度可以用 A620/A280 来表示。因此，根据 在可见和紫外分光光度计中得到的数据就可以推算出提取的藻蓝蛋 白样品的纯度。 （四）藻蓝蛋白的进一步纯化 1、DEAE-纤维素处理、装柱和平衡2、上样、洗脱 3、测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。 具体操作： 3.测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。 具体操作： 用三倍柱床体积的 0.01molLpH6.5 磷酸盐缓冲液平衡。 将初步纯 化得到的藻

10、蓝蛋白液上 DEAE-纤维素柱， 采用 0.01molLpH6.5 磷酸 缓冲液洗脱（含 0.4molLNaCI）进行洗脱，柱上层的深蓝色部分大 多被迅速洗脱下来，只残留少量蓝色。流速控制在 10dmin，用小 试管收集洗脱液，每管收集 2mL（或 30 滴） ，收集 10-12 管（呈现蓝 色的液体内含有目的蛋白） 。测定每管样品的 A620，横横坐标洗脱体 积、纵坐标 A620 值，绘制洗脱曲线。合并所有管中的样品，A620 和 A280 值，计算纯度。 然后用 0.01molLpH6.5 磷酸缓冲液（含 0.6molLNaCI）洗脱， 洗脱下的是藻蓝蛋白。 柱料的再生：用 0.5mlLH

11、Cl 溶液处理柱料，洗 2-3 倍柱床体积， 用水洗至 pH6.0,0,01molLpH6.5 磷酸缓冲液平衡。 四、 数据处理及实验结果 表四 根据数据制作藻蓝蛋白的洗脱曲线 六、思考题 1、蛋白含量测定方法有哪些？各有什么特点？ （1） 、微量凯氏定氮法， （2） 、Folin-酚法， （3） 紫外吸收法， 、 特点： 操作简便迅速， 且不消耗样品 （可以回收） ， 低浓度的盐类不干扰测定。 （4） 、考马斯亮蓝染色法， 2、盐析分离蛋白的原理是什么？ 盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而 夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集， 从而达到盐析沉淀蛋白质的

12、目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电 荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需 的最低盐浓度各不相同研究表明可用 25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除 去杂质，55%(NH4)2SO4 沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过 脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是 大分子物质， 它不能透过半透膜， 而小分子物质可以自由透过半透膜， 顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。 3、离子交换层析纯化蛋白的原理？ 离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性 的羧甲基纤维素（CM-纤维素） ，阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨 基乙基纤维素（D

13、EAE-纤维素） 。蛋白质的混合物与纤维素离子交 换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相 反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变 PH 或离子强度来实现， 与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层 析柱中被洗脱下来。 4、藻蓝蛋白的功能有哪些？ 广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。藻蓝蛋白带有荧光 , 可用作荧光标记物 藻蓝蛋白具有刺激红细胞集落生成，类似红细胞生成素(epo)的作用；藻蓝蛋白 具有补血、 调整白血球和提高淋巴细胞活性的作用； 增加体能、 促进红血球增长， 能增进机体免疫功能，促进生长发育；藻蓝蛋白还具有抑制某些癌细胞的作用； 具有很高的营养价值和医疗价值。 藻蓝蛋白作为天然食用色素，它可以改善食品的色泽，不仅能提高食品的档次， 而且能增加食品