影响Westernblot地因素

1、WORD格式Western blotting的影响因素一：电泳Western blotting 是一个步骤繁多的实验。很多的操作过程，每一步都会对最后的结果产生影响，接下来的这几个帖子我想把我这段时间做 Western blotting 总结的一些影响实验结果的因素写下来，如果你有更好的建议，希望也能奉献出来，大家一起学习进步。电泳过程是第一步， 也是很重要的一步， 好的电泳能让目的条带整齐， 就像人工画的。 要做好电泳也并非易事，我总结有这些方面的因素能影响电泳效果：1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的 PH 值是否在 78 之间。这会直接影响到样品浓

2、缩的效果。 此外， 蛋白样品是否降解、 目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2.凝胶质量。不连续SDS-PAGE 胶对凝胶的要求较高，具体的影响因素有：1.别离胶的PH 值应在 8.8 左右，而浓缩胶的 PH 应在 6.8 左右，最好不要差过 0.5 个 PH 单位，因为这个 PH 条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl 缓冲液的 PH 值是否稳定是很重要的。2.所用丙烯酰胺的纯度和凝胶聚合时间， 不纯的丙烯酰胺会含有丙烯酸， 它会影响到凝胶内部局部PH 环境，因此会影响电泳的效果，没有聚合充分的凝胶会

3、含有游离的丙烯酰胺，也会影响到局部PH环境， 它们还会与蛋白上的氨基、 巯基以及酚羟基反响影响蛋白的泳动。凝胶聚合时间以分离胶 45min ，浓缩胶 20min为宜。此外，单体放置时间过长也会造成丙烯酸的累积。3.凝胶母液混合是否均匀也会影响到凝胶浓度的分布。4.配备的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也会影响到网孔的大小，因此也会对电泳的质量有影响，一般取3040： 1，特殊要求的实验也可以灵活变动。5.APS 及 TEMED 的参加量， APS 极易潮解而失去活性，因此最好是现用现配， APS 不宜参加过多，否那么会氧化蛋白样品。TEMED 作为加速剂，有利于氧自由基的富集， 从而加速聚合

4、反响， 因此所用的TEMED 尽量不要被氧化 氧化后发黄 ，还有参加的 TEMED 也不宜过多或过少，过多会升高PH 值并能与蛋白反响，过少那么会造成聚合不充分， 网孔变大， 并且造成游离丙烯酰胺单体的增多，它们也会和蛋白反响以及改变局部 PH。 6.点样孔底部要平整。3.点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH 值为 8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH 值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。还有，加样之前最好先冲洗一下加样孔底部， 减少没有聚合的丙烯酰胺的影响。还有，尽量从加样孔的中间点样，这样能使得

5、样品在加样孔中的浓度分布尽量均匀，这也会对最终蛋白条带的形状有影响的。加样量也不能过高或过低，过高会影响条带的形状，过低不利于后面的杂交反响。专业资料整理WORD格式4.电泳缓冲液。尽量用新鲜配制的。这样能保证PH 值和离子强度的稳定。专业资料整理WORD格式5.电压条件。电压过高，一方面会使凝胶温度上升，改变凝胶内部PH值，甚至会造成溶专业资料整理WORD格式胶，另一方面，电流过大也不利于蛋白分子的别离，容易造成条带变形，电压过低，又会有样品扩散的影响。我们经常用的浓缩时 80V ，别离时 100V 比较好，条带很平。专业资料整理WORD格式6.其他的因素，如做胶的玻璃板要干净，底下或上面不

6、能有杂质如铁锈等，加别离胶之前要把上面的有机相洗干净， 并尽量吸干水分。 胶板加到电泳槽之后检查胶板底部是否有气泡，有的话用枪吹走，这个会严重影响电流方向，进而影响电泳效果。二：转膜转膜是对 western boltting 最终结果影响最大的一步，砖模质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方面。首先是膜的选择问题。 膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。 例如，要做分子量小于 20kD 的小蛋白， 0.45 m的 NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定， 从而影响到最终结果的可靠性。 而如果所

7、别离的蛋白需要进展测序，那么非 PVDF膜不可，因为只有 PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。 常用的 Western 用膜有 NC膜、 PVDF膜和尼龙膜，它们的一些主要的特点总结如下表：专业资料整理WORD格式nameNC膜尼龙膜灵敏度和 高高分辨率背景低较高结合能力80110 ug/cm2400 ug/cm2材料质地干的 NC膜易脆软而结实溶剂耐受无无性操作程序缓冲液润湿 ,防止气缓冲液润湿泡常规染色， 可用放射检测方式不能用阴离子染料性和非放射性检测PVDF膜高低125200 ug/cm2 适合于 SDS存在下与蛋白质的结合机械强度高有使用前 100%甲醇润湿常规染色， 比较于 NC膜

8、，可用考马斯亮蓝染色，可用于 ECL检测，快速免疫检测。专业资料整理WORD格式0.45um 一般蛋白0.2um 一分子量小于低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖适用X围20kD 蛋白蛋白和蛋白多糖( 主要用在核酸检糖蛋白检测和蛋白质测序0.1um 一分子量小于测中 )7kD 蛋白专业资料整理WORD格式价格价格较廉价廉价较贵专业资料整理WORD格式其次是转膜方法的选择。主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求高，但效率也高。湿法操作要求相对低，花时间多一些。最后是实验操作方面的问题。使用PVDF膜的时候需要进展预处理，这里面会带来一些问题， 如甲醇润湿不够，膜的有些区域不能很好的结合蛋白就会引入

9、误差。膜上面一定不要有油脂类的东西，否那么也会影响蛋白结合和抗体的杂交。(三)：抗体杂交与底物显色Western blot 最常用的检测方法就是用一抗和二抗的方法，其它的如用生物素-链霉亲和素或者 Protein G/A 的方法由于用的比较少，就不在此讨论了。使用一抗和二抗的检测方法是基于信号放大的原理，加大了检测的灵敏度。当然这样做也能减少本钱和提高效率，我们只需要优先的几种标记的特异性好的二抗就能满足大量的实验要求。抗体杂交方面能影响最后实验结果的因素不多。首先是一抗的选择，尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白，一般说明书里标明可以用于W

10、B 的都是可以用来做Western 的。尽量选择小鼠或者兔来源是考虑到其他实验如果要用这种抗体的话，这两种来源的会增加适用X围。单抗的特异性好， 能减少非特异条带。其次是一抗的杂交条件，一般用4过夜为好，当然首先尊重说明书中的建议。再其次就是一抗洗涤的条件，一般采用含0.5 1.0 Tween-20 的 TBST 来洗， 5 分钟一次，洗 3 至 5 次即可，如果遇到背景比较脏的情况，也可以适当提高吐温的含量。二抗一般都是效价很高的， 只要室温下杂交1 小时就可以了， 适当延长也是可以的。 抗体的稀释倍数是由显色方法决定的，可以先用说明书建议的稀释条件做一下，再根据结果调整稀释倍数。显影或显色

11、这一步对结果的影响是非常大的。用荧光素、同位素或者生物素标记的不常用，就不讨论了，最常用的是用标记的，常用的标记酶包括辣根过氧化物酶HRP HorseradishPeroxidase，属于过氧化物酶POD 类和碱性磷酸酶 AP Alkaline Phosphatase ，此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶Glucose Oxidase、半乳糖苷酶 -Galactosidase。这些酶类主要有两种检测方法：底物显色和化学发光。HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于 HRP 比活高、 特异性更强、分子量小 40kD 、稳定和作用底物X围广的优点而得到广泛使用。HRP 的底物种类有不

12、少， 主要可以分为化学发光底物和生色底物2 大类。对于底物的选择， 主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性。HRP 的生色底物显色有DAB ，4-CN ，CN/DAB ，AEC和 TMB 等而得到可溶性产物的底物如 OPD，ABTS 等那么适用于 ELISA 中。这几种显色底物的各种性能的比较见下表：底物DAB4-CNAECTMB学名 3,3-diaminobenzidine4-chloro-1-naphthol3-amino-9-ethyl3,3,5,5tetrahydrochloridecarbazoltetramethylbenzidine分子 214.14178.58210.2

13、8240.4量稳定 好一般避光好性灵敏 250pg1ng100pg专业资料整理WORD格式度背景 一般低高高终产 不能很好的成像容易成像容易成像物成像性颜色 褐色介于蓝色与蓝紫色之间可 棕红色蓝紫色用于 double-staining毒性 有疑有治癌作用无有无HRP 化学发光反响底物可以用琳琅满目来形容。常见的化学发光底物包括Luminol 、 GEHealthcare原安玛西亚的ECL 系列，还有Pierce 公司的 SuperSignal 系列等。 Luminol 系列是经典的HRP 化学发光底物，但现在开展出来的高效的化学发光底物更受欢迎。ECL 在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词，有时竟然是高品质文章的保证之一，可见其经典。 GE Healthcare 公司后来推出的 ECL Plu