第一章 种子的扩大培养

1、1第一章第一章 种子的扩大培养种子的扩大培养第一节第一节 基本概念基本概念第二节第二节 种子培养过程种子培养过程第三节第三节 问题分析及处理手段问题分析及处理手段化学工业出版社化学工业出版社 n 学习目标学习目标v了解基本概念、种子培养的一般过程及培养各阶段的目的要求；v理解种子培养的各种影响因素；v掌握接种方法、种子质量控制方法、种子培养中的问题分析及处理手段。23种子及发酵级数种子及发酵级数 孢子孢子( (或菌丝或菌丝) )接入到体积较小的接入到体积较小的种子罐种子罐中，经培养后形成大量的菌丝中，经培养后形成大量的菌丝一级种子；把一级种子转入一级种子；把一级种子转入发酵罐发酵罐内发酵，称为

2、二级发酵。内发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝多的菌丝二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。三级发酵。使用三级种子的发酵，称为四级发酵。使用三级种子的发酵，称为四级发酵。第一节第一节 基本概念基本概念种子培养种子培养 指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够迅速生长成合格的菌体的过程。迅速生长成合格的菌体的过程。 种子的扩大培养种子的扩大培养 休眠状态休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，的生产菌种

3、接入试管斜面活化后，再经过再经过扁瓶或摇瓶扁瓶或摇瓶及及种子罐逐级扩大培养种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质而获得一定数量和质量纯种的过程。量纯种的过程。4接种接种 将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中菌体接入培养容器的操作过程。菌体接入培养容器的操作过程。 接种量接种量 移种的移种的种子液体积种子液体积和和培养液体积培养液体积之比。之比。 接种龄接种龄 种子罐种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种中培养的菌体开始移种到下一级种 子罐或发酵罐的培养时间。子罐或发酵罐的培养时间。双种法双种法 2个种子罐的种子接人个种子罐的种子接人1个发酵罐的接种方法。个发

4、酵罐的接种方法。倒种法倒种法 以适宜的发酵液倒出部分对另一发酵罐作为以适宜的发酵液倒出部分对另一发酵罐作为种子的接种方法。种子的接种方法。混种法混种法 以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子的以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子的接种方法。接种方法。 5种醪种醪 接入至种子罐中的种子经培养后所得的含有接入至种子罐中的种子经培养后所得的含有一定菌体浓度的种子液。一定菌体浓度的种子液。专性好气菌专性好气菌 只有在空气或氧只有在空气或氧O2 2存在的条件下才存在的条件下才能生长的菌体，氧为呼吸过程中的最终受氢体。能生长的菌体，氧为呼吸过程中的最终受氢体。专性厌气菌专性厌气菌 只有在没有空气或无氧条件下

5、才能生只有在没有空气或无氧条件下才能生长的菌体，分子态氧对它们有毒害作用，如丙酮丁醇长的菌体，分子态氧对它们有毒害作用，如丙酮丁醇梭状芽孢杆菌。梭状芽孢杆菌。兼性好气菌或兼性厌气菌兼性好气菌或兼性厌气菌 既能在空气或有氧条件既能在空气或有氧条件下生长，又能在没有空气或缺氧条件下生长的菌体。下生长，又能在没有空气或缺氧条件下生长的菌体。包括酵母菌及部分细菌。包括酵母菌及部分细菌。6第二节第二节 种子培养过程种子培养过程 包括：孢子制备过程，种子制备过程包括：孢子制备过程，种子制备过程 一、种子制备工艺一、种子制备工艺 实验室阶段和种子罐生产培养阶段实验室阶段和种子罐生产培养阶段1 1实验室种子制

6、备实验室种子制备（1 1）斜面种子培养）斜面种子培养 活化菌种，同时也培养一定数量的斜面活化菌种，同时也培养一定数量的斜面种子。种子。（2 2）液体培养）液体培养 包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培养。养。 液体试管培养液体试管培养 无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取一无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取一环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置培环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置培养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。 三角瓶液体培养（摇瓶种子）三角瓶液体培养（摇瓶种子）782

7、.2.生产车间种子制备生产车间种子制备（1）种子罐级数的确定）种子罐级数的确定 指制备种子需逐级扩大培指制备种子需逐级扩大培养的次数。养的次数。 种子罐级数主要种子罐级数主要决定于菌种的生长特性，孢子发决定于菌种的生长特性，孢子发芽及菌体生长繁殖速度，以及所采用的发酵罐容积。芽及菌体生长繁殖速度，以及所采用的发酵罐容积。 种子制备目的种子制备目的 形成一定数量和质量的菌体。孢形成一定数量和质量的菌体。孢子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在小型罐小型罐内内即可进行。即可进行。 发酵目的发酵目的 获得大量的发酵产物。产物是在菌体获得大量的发酵产物。产物是在菌

8、体大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在大型大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在大型发酵罐内才能进行。同时许多发酵产物的产生菌，其发酵罐内才能进行。同时许多发酵产物的产生菌，其不同的生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。不同的生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。9生长缓慢的菌种，如果没有经过多级种子扩大培养生长缓慢的菌种，如果没有经过多级种子扩大培养就接种到发酵罐，将延长发酵周期，使生产能力下就接种到发酵罐，将延长发酵周期，使生产能力下降。进行多级种子扩大培养后再移种至发酵罐是工降。进行多级种子扩大培养后再移种至发酵罐是工业化生产所必须的。业化生产所必须的。种子罐级数越少，越有利于

9、简化工艺和控制，并减种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减少由于多次转种而带来的染菌机会。少由于多次转种而带来的染菌机会。10种子罐工艺控制：种子罐工艺控制： 孢子量；孢子量； 罐温；罐温； 罐压；通气量；罐压；通气量； 搅拌搅拌 pHpH、离心等参数控制；、离心等参数控制； 种龄；培养基；种龄；培养基； 灭菌及降温时间灭菌及降温时间 11（2 2）接种量的确定）接种量的确定 与该菌在发酵罐中与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件等有关。等有关。 a.a.接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘度增加，接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘

10、度增加，营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。 b b. .接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。 生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施 多数抗生素发酵接种量为多数抗生素发酵接种量为7 71515，有时可加大到，有时可加大到20202525。（3 3）接种龄的确定）接种龄的确定 接种龄以处于生命力旺盛的对数接种龄以处于生命力旺盛的对数生长期的菌丝最为

11、合适，实验确定。生长期的菌丝最为合适，实验确定。12 （4）种子质量的判断方法）种子质量的判断方法 测定的参数有测定的参数有 pH；培养基灭菌后的糖、氨基氮、磷的含量；培养基灭菌后的糖、氨基氮、磷的含量；菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗色素、颗粒等粒等)；其他参数。如转种前的抗生素含量、某种酶其他参数。如转种前的抗生素含量、某种酶活力等。活力等。 13v（5）种子质量的控制措施）种子质量的控制措施 v菌种稳定性检查菌种稳定性检查 定期考察和挑选菌种；对菌种定期考察和挑选菌种；对菌种进行自然分离；摇瓶发酵，测定其生产能力，从中进行自然分离；摇瓶发酵，测定其生

12、产能力，从中挑选具有较高生产能力的高产菌株。挑选具有较高生产能力的高产菌株。v适宜的生长环境适宜的生长环境 包括营养丰富的培养基、适宜包括营养丰富的培养基、适宜的培养温度和湿度、合理的通气量等。的培养温度和湿度、合理的通气量等。v种子无杂菌检查种子无杂菌检查 每移种一步均需要进行无菌检每移种一步均需要进行无菌检查，并对种子液进行生化分析。查，并对种子液进行生化分析。14米孢子质量米孢子质量无菌状况必须保证（无菌室操作，无菌样监测，无无菌状况必须保证（无菌室操作，无菌样监测，无菌室的管理，菌室的管理， 灭菌锅温度和压力的校验）灭菌锅温度和压力的校验） 菌落形态的挑选菌落形态的挑选 原材料的质量保

13、证（玉米浆原材料的质量保证（玉米浆/小米等有机氮源质量易小米等有机氮源质量易波动，产地波动，产地/厂家厂家/摇摇 瓶）瓶）培养基（配方，灭菌，孢子数量需求）培养基（配方，灭菌，孢子数量需求） 接种量适当接种量适当 培养过程温度和湿度（空调及恒温培养过程温度和湿度（空调及恒温恒湿机的保障）恒湿机的保障） 培养时间培养时间15种子罐生长的好坏种子罐生长的好坏v无菌状况必须保证（罐体本身、各系统设备及管无菌状况必须保证（罐体本身、各系统设备及管线的灭菌）线的灭菌） v培养基（配方，灭菌及降温过程）培养基（配方，灭菌及降温过程）v原材料质量的稳定（玉米浆原材料质量的稳定（玉米浆/蔗糖及无机盐的质量蔗糖

14、及无机盐的质量控制）控制） v接种孢子数量控制接种孢子数量控制 v工艺控制：罐温；罐压；空气；工艺控制：罐温；罐压；空气；pHpH；搅拌；离心；搅拌；离心量；移种周期控制量；移种周期控制163 3接种方法接种方法（1）压差接种）压差接种 利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。 孢子悬液接种孢子悬液接种 种醪接种种醪接种 （2）注射接种）注射接种 用于种子罐接种，在罐顶接种管口压用于种子罐接种，在罐顶接种管口压盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。（3）摇瓶直接进罐法）摇瓶直接进罐法 适合

15、种子罐接种，一般需三人适合种子罐接种，一般需三人配合操作。配合操作。17二、注意事项二、注意事项（1 1）按照无菌操作）按照无菌操作（2 2）消毒灭菌一定要彻底、干净）消毒灭菌一定要彻底、干净（3 3）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格的无菌概念，避免出现二次污染。的无菌概念，避免出现二次污染。（4 4）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次( (三代三代) )，以免由

16、于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要，以免由于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使用。用。（5 5）按不同菌种的不同生理特征，选用不同的工艺来生产发）按不同菌种的不同生理特征，选用不同的工艺来生产发酵所用的种子。即使是相同的发酵生产，也要根据本单位的酵所用的种子。即使是相同的发酵生产，也要根据本单位的具体条件对工艺操作方法加以调整。具体条件对工艺操作方法加以调整。 18（6 6）在种子制备过程中，要特别加强对影响种子质）在种子制备过程中，要特别加强对影响种子质量的各种因素的调控。量的各种因

17、素的调控。（7 7）对已有的优良生产品种的菌种，要采取相应的）对已有的优良生产品种的菌种，要采取相应的方法，使其在尽量长的时间内保持生产性能稳定、方法，使其在尽量长的时间内保持生产性能稳定、死亡率低、变异少。死亡率低、变异少。（8 8）已经退化的菌种，要及时进行分离纯化，通过）已经退化的菌种，要及时进行分离纯化，通过复状，恢复菌种的优良性能。复状，恢复菌种的优良性能。（9）种子通过接种管道进行移种时，移种过程中要）种子通过接种管道进行移种时，移种过程中要防止接受罐表压降至零，否则会引起染菌。防止接受罐表压降至零，否则会引起染菌。19第三节第三节 问题分析及处理手段问题分析及处理手段一、种子培养

18、过程中影响因素一、种子培养过程中影响因素1孢子培养过程中的影响因素孢子培养过程中的影响因素（1 1）原材料质量）原材料质量 无机离子（如微量元素无机离子（如微量元素MnMn2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+）能刺激孢子的形成，磷含量也会影响孢子的质量。能刺激孢子的形成，磷含量也会影响孢子的质量。（2 2）培养温度）培养温度 过低菌种生长发育缓慢；过高菌体代谢活动过低菌种生长发育缓慢；过高菌体代谢活动加快，缩短培养时间，使孢子成熟早，易老化，引起菌丝过加快，缩短培养时间，使孢子成熟早，易老化，引起菌丝过早自溶。早自溶。（3 3）湿度）湿度 湿度小，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。湿度小

19、，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。（4）斜面冷藏时间）斜面冷藏时间 孢子成熟，不易导致菌体自溶，冷藏时间孢子成熟，不易导致菌体自溶，冷藏时间可长；反之，应缩短冷藏时间。可长；反之，应缩短冷藏时间。（5）接种量）接种量 接种后菌落均匀分布整个斜面接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落隐约可分菌落者者为正常。过小，菌落稀疏；过大，菌落密集一片。为正常。过小，菌落稀疏；过大，菌落密集一片。 202 2种子罐培养过程中的影响因素种子罐培养过程中的影响因素 （1）原料）原料 选择有利于选择有利于孢子发芽孢子发芽和和菌丝生长菌丝生长的培养基，营的培养基，营养易于被菌体养易于被菌体直接吸收和利用直接吸收和

20、利用，成分适当，氮源、维，成分适当，氮源、维生素含量较高。生素含量较高。 营养成分要尽可能和发酵培养基接近，且略稀营养成分要尽可能和发酵培养基接近，且略稀薄为宜。薄为宜。（2 2）培养条件）培养条件 温度温度 温度高，细胞中的生化反应快，生长速率温度高，细胞中的生化反应快，生长速率快；菌体蛋白质、核酸等对温度较敏感，温度过高可快；菌体蛋白质、核酸等对温度较敏感，温度过高可能被破坏。微生物生长温度在能被破坏。微生物生长温度在-10-109595。发酵菌株发酵菌株生长最适温度为生长最适温度为20204040。21pHpH值值 影响微生物对营养物质的吸收、酶的形成及影响微生物对营养物质的吸收、酶的形成及其活力等。其活力等。大多数为大多数为pH4pH49 9，少数在，少数在pH2pH1010。通气量通气量 保证菌种代谢对氧的需求，提高种子的质保证菌种代谢对氧的需求，提高种子的质量。量。搅拌搅拌 保证溶氧及种子罐内各处条件均一，利于种保证溶氧及种子罐内各处条件均一，利于种子的培养。可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。子的培养。可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。22二、常见问题及其处理手段二、常见问题及其处理手段1.1.种子生长缓慢：种子生长缓慢： 主要原因：