木瓜蛋白酶性质测定

1、木瓜蛋白酶性质测定一、实验目的1、学习并掌握木瓜蛋白酶活性测定的基本原理。2、掌握影响木瓜蛋白酶性质的不同因素，如激活剂(如EDTA、半胱氨酸)，抑制剂、pH 等。二、实验原理木瓜蛋白酶（Papain）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量约为23 000 左右。木瓜蛋白酶是单条肽链，由211个氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和 EDTA等；抑制剂有巯基试剂，包括重金属、羧基试剂和过氧化氢等。酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275 nm 处有

2、吸收峰，根据测定275 nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。三、仪器和试剂1、市售木瓜蛋白酶；2、仪器设备：磁力搅拌器（机）；离心机7000rpm（冷冻式）；紫外分光光度计；水浴槽；冰箱及常规玻璃仪器。四、实验步骤（一）激活剂（EDTA）对木瓜蛋白酶活力的影响1、试剂（1）3 mg·mL-1 木瓜蛋白酶液（用 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液，pH 7.2 配制）；（2）0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液，pH 7.2 ；（3）激活剂：用 0.1 mol

3、83;L-1 磷酸缓冲液（pH 7.2）配制含10 mmol·L-1半胱氨酸，分别含有0，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0 mmol·L-1 EDTA 的6 种混合液 ；（4）1%酪蛋白溶液：用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）配制 ；（5）15%三氯乙酸（TCA）溶液。2、方法EDTA 浓度（mmol·L-1）00.20.61.02.04.0管 号0 10 10 10 10 10 1酶 液（mL）0.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.2EDTA（mL）1.8 1.81.8 1.81.8 1

4、.81.8 1.81.8 1.81.8 1.837 水浴预热10 min1%酪蛋白（mL）0 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.037 水浴10 minTCA（mL）2.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.01% 酪蛋白（mL）1.0 01.0 01.0 01.0 01.0 01.0 0摇匀，静置5 min 过滤（或离心）A275nm0 2.0280 2.0360 2.0550 2.1370 0.5780 0.082（二）抑制剂（过氧化氢）对木瓜蛋白酶活力的影响1、试剂配制浓度分别为0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mmo

5、l·L-1 的过氧化氢溶液。2、方法过氧化氢浓度（mmol·L-1）00.250.51.02.04.0管 号0 10 10 10 10 10 1酶 液（mL）0.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.2过氧化氢（mL）0.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.237 水浴预热10 min1%酪蛋白（mL）0 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.037 水浴10 minTCA（mL）2.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.01% 酪蛋白（

6、mL）1.0 01.0 01.0 01.0 01.0 01.0 0摇匀，静置5 min 过滤（或离心）A275nm0 1.5950 1.5050 1.5000 1.4450 1.0350 1.330（三）不同pH 值对木瓜蛋白酶活力的影响1、试剂pH 5.0 缓冲液 0.1 mol·L-1 乙酸乙酸钠缓冲液；pH 6.0 缓冲液 0.1 mol·L-1 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液；pH 7.0 缓冲液 0.1 mol·L-1 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液；pH 8.0 缓冲液 0.1 mol·L-1 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液；pH 9.3 缓冲液 0.1

7、 mol·L-1 硼砂氢氧化钠缓冲液；2、用以上缓冲液分别配制不同pH 值的激活剂（1 mmol·L-1EDTA）和1%酪蛋白溶液。缓冲液pH5.06.07.08.09.3管 号0 10 10 10 10 1酶 液（mL）0.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.2EDTA（mL）1.8 1.81.8 1.81.8 1.81.8 1.81.8 1.837 水浴预热10 min1%酪蛋白（mL）0 1.00 1.00 1.00 1.00 1.037 水浴10 minTCA（mL）2.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.01

8、% 酪蛋白（mL）1.0 01.0 01.0 01.0 01.0 0摇匀，静置5 min 过滤（或离心）A275nm0 0.0340 0.0110 0.1130 0.0430 0.023五、实验结果分析1、各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。2、做好实验曲线绘制及数据记录。3、对该实验有哪些体会。1.答：激活剂（EDTA）对木瓜蛋白酶活力的影响EDTA 浓度（mmol·L-1）00.20.61.02.04.0管 号0 10 10 10 10 10 1A275nm0 2.0280 2.0360 2.0550 2.1370 0.5780 0.082抑制剂（过氧化氢）对木瓜蛋白酶活力的影响过氧化氢浓度（mmol·L-1）00.250.51.02.04.0管 号0 10 10 10 10 10 1A275nm0 1.5950 1.5050 1.500