免疫固定电泳操作规程

1、WORD格式免疫固定电泳操作规程免疫固定电泳操作规程一工程名称免疫固定电泳HYDRAGEL IMMUNOFIXATION二检验方法名称琼脂糖凝胶免疫固定电泳三方法学原理血清蛋白电泳中出现的异常条带主要存在于 -球蛋白和 -球蛋白区域， 通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是一种简单的技术， 电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上，通过下列四个步骤：1蛋白质在琼脂糖凝胶内进展电泳别离。2电泳后已别离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶外表的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。3使用吸水纸和清洗将未

2、沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。4将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后观察到的异常蛋白区带进展比较。为了准确识别单克隆区带， 样品同时在六条泳道上进展测试。 经电泳后， ELP 作为参考泳道以显示电泳后的蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它们与抗血清， (IgG) 、 (IgA) 、 (IgM) 重链和、 轻链游离和非游离反响与否进展鉴别。该技术简单、快速、图象清晰，易于解释结果。四方法学溯源自 1930 年由 Tiselius 发现了移界电泳 moving boundary eectrophoresis ，而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电

3、泳 zone elecrrophoresis所抑制，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。 通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。五仪器一型号： SEBIAHYDRASYS (PN1210)二分析和计算参数：1处理量：约18 个样本 / 小时2所需样本量： 10ul3检验时间：约55 分钟4重复性：有良好的批内和批间重复性5电泳参数：电压0 300V 可选至3000V 电流 0 500mA功率 0 100W专业资料整理WORD格式1专业资料整理WORD格式免疫固定电泳操作规程六试剂及配套品一试剂1 HYDRA

4、GEL 1 IF试剂盒HYDRAGEL 2 IF试剂盒HYDRAGEL 4 IF试剂盒HYDRAGEL 9 IF试剂盒（ 1 商标： SEBIA（ 2 包装规格： 10 测试 /20 测试 /40 测试 /90 测试（ 3 货号： PN4301/ PN4302/ PN4304/PN43092脱色液（ 1 商标： SEBIA（ 2 包装规格： Pack for 10 100ml（ 3 货号： PN4540（ 4 成分：柠檬酸3洗涤液（ 1 商标： SEBIA（ 2 包装规格： Pack for 10 80ml（ 3 货号： PN4541（ 4 成分：叠氮钠4稀释剂（ 1 商标： SEBIA（ 2

5、 包装规格： Pack for 1 5ml（ 3 货号： PN4587二配套品： IF 试剂抗体（ 1 商标： SEBIA(2 )包装规格： Pack for 5 1ml（ 3 PN4315七操作步骤 开机，启动电泳仪。 将 1 只用于1， 2IF， 2 只用于4IF或 3 只 (用于 9IF)点样梳置于整外表，有数字的一端向上，在 2 分钟内完成每块加样梳的加样，每孔加 10ul 样品，然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内 5 分钟。电泳 / 免疫固定泳道孔号ELPGAMKLHydrasys 1 IF123456Hydrasys 2/4 IF1或3号样本2345672或4号样本9101112131

6、4Hydrasys 9 IF1,4或 7号样本1234562,5或 8号样本7891011123,6或 9号样本131415161718专业资料整理WORD格式2专业资料整理WORD格式免疫固定电泳操作规程 选择相应的“IF电泳程序， 从包装袋内取出缓冲条，将其固定在电极支架背侧的钉上，再取出凝胶，用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶外表多余的液体，在温控板外表下 1/3 处加 200ul 蒸馏水或去离子水，将凝胶片底边紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平，注意凝胶片下面勿出现气泡。 自然放下支架，从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架，1、 2IF 的点样梳置于支架 6 号位，4IF的2

7、只点样梳那么分别置于3 号和 9 号，9IF的3只点样梳那么分别置于2，6 号和 10 号，注意点样梳上的数字必须面对操作者，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色箭头“ START键，电泳开场，确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。 电泳仪自动发出蜂鸣声, 提示电泳完毕， 进展免疫固定操作。翻开电泳盖， 将加样梳和缓冲条丢弃， 移走两支架， 用湿纸巾擦拭电极丝，将抗体加样条装入抗体加样架上，按如下要求将动物血清抗体参加抗体加样条：Hydrasys 1 IF用 6 孔抗体加样条 : 每孔加 8 l 抗体Hydrasys 2/4IF用 15 孔抗体加样条 : 2 人份每孔加8 l 抗体， 4人份每孔加12

8、l 抗体Hydrasys 9 IF用 18 孔抗体加样条 : 每孔加 8 l抗体固定好抗体加样架 , 将抗体加到凝胶片上。然后关上电泳舱盖，按“Start 键开场免疫固定。 10 分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，提示“PAPER BLOTTING，移走抗体加样架，弃去抗体加样条， 放一厚滤纸光面向下盖于于凝胶外表, 左手固定好滤纸， 右手手指用力的摩擦滤纸外表，注意勿将滤纸移动，关闭电泳舱盖，按“Start 键开场凝胶外表多余抗体的吸收。 3 分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，翻开电泳舱盖，移去滤纸，关闭舱盖，按“Start 键开场凝胶片的枯燥。 6 分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，翻开电泳舱盖，取出

9、凝胶片，用湿纸巾擦拭温控板，将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中，在检查洗液瓶中是否有400ml 洗液，染色液瓶内是否有 300ml 染色液，脱色液瓶内是否有 1000ml 脱色液以及是否排空了废液瓶后，菜单上选择染色指令，按“ Start 键开场染色。 在染色、脱色以及枯燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶支架，将烘干的胶片取下。八临床意义对多发性骨髓瘤、 Waldenstrom 巨球蛋白血症、分泌型骨髓瘤、轻链病、重链病等研究有重大意义。1 正常人体内有正常的免疫球蛋白分布，故免疫固定电泳图谱可见均匀分布的IgG/A/M2. 在 IgG/A/M 及 Kappar 、 lammda

10、的泳道上发现浓集的条带即为病理性的。九标本要求 取新鲜血清进展分析，根据临床实验室对各种试验所使用的操作程序进展血清样本的采集，样本置于冰箱内2 8可保存一周，假设冰冻可延长保存时间至少一个月。冰冻的血清样本参加0.02g/dl 的叠氮钠可以增加其存放稳定性。专业资料整理WORD格式3专业资料整理WORD格式免疫固定电泳操作规程 为防止抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作如下稀释，并混匀。泳道血清 (ul)稀释剂 (ul)蛋白电泳(ELP) 和其他免疫球蛋白固定泳道3060IgG 免疫固定泳道20210 特殊情况当总免疫球蛋白的水平20g/L ，稀释剂量加倍除了ELP 泳道当总免疫球蛋白水平5g/L ，稀释剂量减半除了ELP 泳道冷藏或冰冻后，某些样本尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下， 加 25ul 液化剂于 75ml 血清中， 混匀 15 秒。然后按规定程序继续进展。某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下 i准备1巯基乙醇这种复原剂可在室温于未封闭微管内保存1 周 ii 加 25ul 复原剂于75ul 血清中 iii 混匀并