化学发光免疫法检测AFP的空白限-检出限和定量检测限的建立与

1、精选优质文档-倾情为你奉上临床检验杂志2010年11月第28卷第6期Chin J Clin Lab Sci ，Nov2010，Vol28，No6469764X （2010）06-469-03文章编号：1001-质量管理研究化学发光免疫法检测AFP 的空白限、检出限和定量检测限的建立与评价*温冬梅，张秀明，王伟佳，黄福达，何娟，肖礼红，欧阳能良，吴剑杨，李曼，庞嘉琳（中山大学附属中山医院检验医学中心，广东中山）摘要：目的建立并评价化学发光免疫法检测甲胎蛋白（AFP ）的空白限（LoB ）、检出限（LoD ）和定量检测限（LoQ ）。方法参A 文件，考CLSI EP17-将AFP 空白样品和系列低

2、浓度样品在Bayer Centaur 240化学发光免疫检测系统上进行检测，依据数据LoD 和LoQ ，采用相应的统计学方法，确定血清AFP 的LoB 、同时用传统方法建立AFP 的检测低限（LLD ）、生物检的分布规律，测限（BLD ）和功能灵敏度（FS ）。结果A 方案建立的LoB 为080ng /ml，LoD 为260ng /ml，LoQ 为330ng /ml；应用EP17-应用两种方法建立的LoB 和LLD 均低于BLD 为220ng /ml，FS 为220ng /ml。结论用常规方法建立的LLD 为100ng /ml，Bayer Centaur 240化学发光免疫系统检测AFP 的分

3、析灵敏度得到验证确认；实验室在验证仪仪器说明书声明的灵敏度性能，器声明的LoB 时，应同时建立检测系统的LoD 和LoQ ，以便为临床提供更为可靠的检验结果。两种评价方案均具有实用性，国内实验室可视具体情况选择不同的评价方案。关键词：甲胎蛋白；方法学评价；分析灵敏度中图分类号：R446文献标识码：A1根据医疗机构临床实验室管理办法和医时取不同浓度的低浓度样品各1支，待溶解混匀后与常规标本同等条件下进行测定。15常规方法4-5参照文献确定AFP 的LLD 、BLD 和FS 。空白样品作10次批内重复测定，低浓度样品作日间重复测定，共10d ，记录光强度值（RLUs ）。16EP17-A 方法A

4、文件3确定AFP 参照EP17-LoD 和LoQ 。空白样品进行60次测定，的LoB 、每日1批，每批重复检测12次，共5d ，记录浓度值。6个浓度的低浓度样品作日间重复测定，每日2批，每批共5d ，记录浓度值。相隔时间2h ，17统计方法LLD 、BLD 和FS 的统计方法参照文献空白限（LoB ）按国际标准化组织（ISO ）的1714-5。172建议，设定类错误和类错误水平均为5%（=5%），若空白值呈正态分布，按下式计算空白限：LoB =B +1645B （式中B 和B 分别为空白样品检测值的均值和标准差）。若空白值呈非正态分布，则用非参数方法估计第95百分位数（Pct B ）的N B

5、（/100）+05即：LoB =Pct B 100-，即：LoB =在值，095 N B +05位置的结果。位置的结果=在注：式中N B 是重复检测的次数，是百分位数。173检出限（LoD ）若低浓度样品检测结果呈学实验室认可的要求2，临床实验室必须对检测系统的主要分析性能进行验证确认或分析评价，证实其能够满足预期的质量要求后才能用于常规检测。分析灵敏度是检测系统的主要性能指标之一，本文参考美国临床和实验室标准化协会（CLSI ）发布的检出限和定量检测限的确定方案，建立化学发光免疫法检测AFP 的空白限（LoB ）、检出限（LoD ）和定量检测限（LoQ ），并与传统方法比较，现报道如下。11

6、1材料与方法检测系统Bayer Centaur 240化学发光免疫4-53建立的检测低限（LLD ）、生物检测限（BLD ）和功能灵敏度（FS ）进行分析仪及原装试剂、校准品（批号为CD54L 、CD54H ）和质控品（批号为和）。1213空白样品低浓度样品用Bayer 原装配套AFP 稀释液作用Bayer 原装配套AFP 稀释液为空白样品。对AFP 浓度为550ng /ml的新鲜血清作系列稀释，配制成一系列低浓度的AFP 样品，其理论浓度（ng /ml）分别为0（空白）、110、165、220、330、440、550，介于预期检测限浓度1 4倍。14样品保存将配制好的系列低浓度样品分装于带盖

7、一次性试管内于20 冰箱保存，每次测定*基金项目：广东省医学科研基金项目（2009A），中山市科技计划项目（20091A038）。1976年生，作者简介：温冬梅，女，副主任技师，学士，主要从事临床生物化学检验和实验室管理工作。E-mail ：zxm0760163com 。通讯作者：张秀明，主任技师，硕士研究生导师，470临床检验杂志2010年11月第28卷第6期Chin J Clin Lab Sci ，Nov2010，Vol28，No6正态分布，计算多个低浓度样品的综合标准差（SDs ）：SD s =1SD 1+n 2SD 2+n 3SD 3+n m SD m n 1+n 2+n 3+n m和

8、第58个观察值的均数。将60个空白检测值由小第57和第58位置均为08到大排序（见表2），ng /ml，故LoB =08ng /ml。表2秩号n 2n m 代表不同低浓度样品的自由度。式中n 1，LoD =LoB +C SD S C 是标准正态分布第95百分C =1645/（11/4f ），f 是SDs 位数值的校正因子，。的自由度若低浓度样品检测结果不呈正态分布，或不能按非参数方法估计LoD ，计算公式转化为正态分布，如下：LoD =LoB +D S ，（D S ，是低浓度样品测定中位数和第5个百分位数值的间距）。174定量检测限（LoQ ）依据临床要求和室间质量评价的允许误差，设定本实验室

9、AFP 的总误差在不考虑分析偏差的条件下，总误差目标为20%，=2CV ，如果低浓度样品的CV 1/2总误差，则LoQ =LoD 。221结果检测低限（LLD ）批次60个空白值中最高的10个值（ng /ml）空白值0506060608秩号空白值080808081025检出限（LoD ）低浓度样品测定结果见表3。60个低浓度样品检测结果呈非正态分布，使用非参D S ，数程序估计LoD ，即：LoD =LoB +D S ，是低浓度样品测定值中位数和低浓度样品的第5个百分位数值的间距，低浓度样品中位数=320，第5百分位数的值=（60 005+05）=第35秩号的值=140，D S ，故LoD =

10、LoB +=320140=180，D S ，=080+180=260ng /ml。表3110160170130210230250140120260150低浓度AFP 样品测定结果（ng /ml）165180210160280180190290140220190220270300250280320290250180250330330350390410390440390320320370370490420510480460490460430430520490550620550550570590580520590590550空白样品10次重复测定光A 空白为19979，强度值（RLUs ）的均值珔标

11、准差（s ）为126，按997%的可信限，空白样品RLUs 的3s 为378，550ng /ml检测限样本的RLUs 为2088，RLUs 为378时相当于：LLD =（378/2088） 550=100ng /ml，所以本法的LLD 为100ng /ml。22生物检测限（BLD ）220ng /ml实验样品的RLUs 减3s 后RLUs 为384，刚大于378，故本法的生物检测限为220ng /ml。结果见表1。表1低浓度样品AFP （ng /ml）测定的RLUs 结果及生物检测限110RLUs X A 空白s CV （%）x 3s 珋9271516523384328854713425317

12、5426定量检测限（LoQ ）本实验室依据临床需求及权威机构规定的分析质量要求设定化学发光免疫法检测AFP 的总误差目标为20%，在不考虑分析偏允许总误差（TEa ）=2CV ，即CV =1/差的情况下，2TEa 。AFP 浓度在330ng /ml时检测的日间CV 为956%，刚好小于10%，符合质量目标要求，因此LoQ =330ng /ml，结果见表4。表4化学发光法测定低浓度AFP 样品（ng /ml）的日间CV110x （ng /ml）珋s （ng /ml）CV （%）182049267816520404622482202720411505330375036956490467030650

13、55057102747923功能灵敏度（FS ）以日间CV 为20%时对应220ng /ml浓度低浓度样品具有的平均浓度为FS ，的实验样品日间CV 为193%，最接近20%，故FS 为220ng /ml。结果见表1。24空白限（LoB ）空白样品的检测结果呈非正态分布，故用非参数程序估计LoB ，即估计第95百LoB =N B （/100）+05=分位数（Pct B ）的值，60 （95/100）+05=575位置的结果，即第57松柏3讨论Petersen 、Gregori Casals 、国内外相关报道中，郑4-8等分别对化学发光免疫检测系统检测不同临床检验杂志2010年11月第28卷第6

14、期Chin J Clin Lab Sci ，Nov2010，Vol28，No6471BLD 和FS 进行确定或验证，项目的LLD 、本实验以AFP 为例对LLD 、BLD 和FS 的研究结果与文献4-5报道的结果基本一致，证实了厂商声明的性能。A 方案建立的LoB 本实验结果显示，用EP17-为08ng /ml，低于仪器说明书声明的灵敏度13ng /ml，LoD 为260ng /ml，LoQ 为330ng /ml。即该检测系统在符合质量要求下能可靠地检出AFP 的最低实际浓度为330ng /ml。本实验室用该检测系统检测AFP 结果报告时，若AFP 结果低于08“分析物未检出，；ng /ml，

15、则报告浓度小于08ng /ml”若AFP 检测结果高于08ng /ml小于260ng /ml，“有分析物检出，则报告但不能准确定量，浓度小于260ng /ml”；若AFP 检测结果高于330ng /ml，则直接报告检测结果。临床医生可放心使用浓度高于330ng /ml的AFP 结果。两种灵敏度评价方法主要有以下区别9能符合临床的质量需求。（5）目前所有的试剂厂商在试剂说明书中只提供了按常规方法检测得出的检测低限，没有提供必须满足实验室质量要求的定量检测限以及在接近定量检测限处的不确定度，厂商A 文件对检测系统所有检验项目的检若参照EP17-实验数据的收集和测低限和定量检测限进行确定，统计学处理

16、科学严谨，可以方便临床实验室通过简单的程序对其建立的检测限值及不确定度进行验证和确认。A 文件建立LoD 和LoQ 是综上所述，用EP17-评价化学发光免疫检测系统灵敏度性能的标准方法，可更好地为临床提供准确可靠的AFP 低浓度结果，为临床诊断、治疗监测提供重要信息，但成本较高。常规方法操作简便、成本较低，若数据呈正态分布，也具有较高的应用价值。国内实验室可视具体情况选择不同的评价方案。4参考文献：（1）常规方法确定化学发光免疫检测系统检测AFP 的LLD 、BLD 和FS 的空白样品检测数为10次，低浓度A 方案要求确定LoD 的样品检测数为10次。EP17-最小检测数为60次，样品重复检测

17、的次数多，估计的LoD 不确定度较小，结果更可靠。（2）参照常规方法确定化学发光免疫检测系统检测AFP 的LLD 、BLD 、FS 均使用光强度值（RLUs ）来计算，但目前实验室部份仪器存在局限性，即只能报告分析物的浓度，而没有原始的分析信号。所以常规方法不适用于实验室对所有仪器的灵敏度进行评价。参照EP17-A 文件进行化学发光免疫分析系统检测AFP LoD 和LoQ ，的LoB 、直接使用检测出的分析物浓度进行计算，符合实验室的实际情况，统计分析输入检测数据时简便易行。（3）常规方法对灵敏度性能评价均假设实验数据呈正态分布，使用参数的程序进行估计，但实际中大部份实验数据均呈非正态分布，E

18、P17-A 方案可以弥补常规方法的不足，可根据实验LoD 。数据分布选择参数或以非参数程序确定LoB 、（4）常规方法确定生物检测限只是考虑了样品单次检测的信号有95%或99%的可能性，这样的低值结A 方案考虑果有很大误差，影响了临床应用；EP17-了分析物在低水平处的偏倚与不精密度，以检验的充分保证了低浓度检测结果允许误差来估计LoQ ，12006-02-07中国卫生部医疗机构临床实验室管理办法Z 2ISO /DIS151892-2007医学实验室质量和能力的要求S 2007中国国家实验室国家认可委员会，3EP17-AProtocols for Determination of Limits of Detection and Lim-its of Quantitation ；Approved Guideline S NCCLS ，2004，1-394Petersen AB ，G