2022年卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法(1)

1、卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法.用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。平安解冻配套：1. 1瓶4ml解冻液TS2. 1瓶1.5ml稀释液(DS)3. 1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4. 1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5. 1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37的培养箱里加温将所有解冻液倒入生殖板里。*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。注意：用巴斯德管吸取一个大小适宜的卵母细胞直径：140um或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1. 迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。图一2. 用巴斯德管吸取卵母细胞胚胎，轻轻地将其放入DS底部

2、，浸泡3分钟。图二3. 用巴斯德管吸起卵母细胞胚胎，轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。图三4. 用巴斯德管吸起卵母细胞胚胎，轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞胚胎自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。图四5. 将卵母细胞胚胎转移到装有适宜培养液的培养皿中。放进37的培养箱中完成恢复。注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎那么要3小时。质量控制测试：每一批平安解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试SAL 10-3 LAL拉尔内毒素测试 小老鼠胚胎试验一个细胞保存方法：*保存于4-8*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。成分：*血清替代补充*根本培养基M-199 内含的HEP

3、ES*蔗糖参考文件此局部请看原件.玻璃化第一局部：所需材料*玻璃化配套No.0 根底液BS：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液ES: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液VS: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管型号：MT-150*显微镜关掉加热板*秒表或计算器带计算功能*液氮消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小适宜。卵母细胞内直径：140

4、um，胚胎内直径：140-200um，尽量减少与玻璃解冻液的接触以提高解冻后的成活率。平衡这个步骤，卵母细胞与胚胎步骤不一样。第二局部 玻璃化准备1. 将BS、ES和VS放到室温25-27。2. 在管上写上客户信息3. 冷却架要添加液氮至90%4. 将装有卵母细胞或者胚胎的培养皿从培养箱中取出，用巴斯德管取出卵母细胞或者胚胎在显微镜下观察卵母细胞或胚胎的质量状况。比拟卵黄周隙与透明带的宽度，并做记录,这样更容易知道在ES浸泡后完成平衡液步骤。卵黄周隙透明带注意：如果用的是卵母细胞那么要将积云细胞出去。 第三局部 平衡卵母细胞平衡1在复制板边上分别写上BS, VS1和VS2.用巴斯德管取出20u

5、l的BS，300ul VS1和300ul VS2,放进复制板里看下列图。卵母细胞平衡2用巴斯德管取出卵母细胞，将其转移到BS20ul溶液底部。卵母细胞平衡3 (3分钟)调整秒表有计算功能，为以下步骤检查并设定好秒表。沿着复制板孔的边缘移动巴斯德管，轻轻地将20ul ES增加到有卵母细胞BS溶液的顶部，放置3分钟。 卵母细胞平衡4 (3分钟)仿照上个步骤再增加20ul ES溶液到顶部，放置3分钟。 卵母细胞平衡5 (9分钟)仿照上个步骤再增加240ul ES溶液到顶部，放置9分钟。在平衡液这个局部，卵母细胞大小要完全恢复，在卵母细胞在ES浸泡前，卵黄周隙宽度平均的时候，这个局部就完成了。 玻璃化

6、配套胚胎平衡胚胎-平衡1在复制板边上分别写上ES, VS1和VS2.将 将ES和两瓶VS充分混合。用巴斯德管分别取出300ul 溶液，立刻放进复制板里看右图。胚胎-平衡2用巴斯德管吸取胚胎于巴斯德管顶部，看右图。然后将胚胎放到ES中顶部。胚胎-平衡3 12到15分钟调整秒表有计算功能，为以下步骤检查并设定好秒表。胚胎于30秒内自由脱落，它会自发地开场收缩，在ES渗透后，胚胎就会逐渐恢复到原来的大小，此时平衡步骤就完成了。注意：胚泡平衡要等待卵黄周隙消失。胚泡玻璃化解冻最好的时候是胚胎直径到达140-180ul的时候。胚胎平衡的时间取决于胚胎的大小和质量，好的胚胎和小的胚胎所需时间就比拟少。举例

7、来说，一个好的胚胎8分钟完全恢复，平衡步骤已经完成。如果不能确定胚胎是否完全恢复，那么停顿平衡，12分钟进展原核细胞分裂， 15分钟进入桑椹胚和囊胚阶段，这样就足够了。第四局部 玻璃化这个局部对于卵母细胞和胚胎都是一样的，以下1到7步骤应在60-90秒内完成。玻璃化 1从ES溶液中用巴斯德管顶吸出卵母细胞胚胎，看右图。然后将胚胎胚胎放到VS1中顶部,尽量减少携带ES溶液。仅将卵母细胞胚胎带进VS1，为了防止将ES带进VS1，首先将ES吹到孔的外边，将新鲜的VS1吹到孔的外面，用VS1吸入巴斯德管内。玻璃化21分钟内用巴斯德管吸入卵母细胞胚胎并放入VS1，在卵母细胞胚胎周围快速地搅拌5次。重新吸

8、入卵母细胞胚胎，在另外的位置放下VS1，在其周围快速地搅拌3次。改变卵母细胞胚胎周围的VS1溶液，直到ES溶液视觉上消失了。玻璃化30.5分钟将巴斯德管内的VS1溶液吹到孔外，将VS2溶液吸入巴斯德管，然后从VS1溶液中将卵母细胞胚胎吸入巴斯德管。将其放入VS2中，尽量减少带入VS1。在卵母细胞胚胎周围快速地搅动，变换2次位置，请看上图。当卵母细胞胚胎周围全被VS溶液包围并能观察到卵母细胞胚胎外表因脱水而萎缩时，此步骤即完成。玻璃化4将载体放在显微镜下观察标签要朝上，调整将重点放在载体黑色标志上面。看下列图。玻璃化4将载体放在显微镜下观察标签要朝上，调整将重点放在载体黑色标志上面。看下列图。玻

9、璃化5用巴斯德管从VS2吸取收缩了的卵母细胞胚胎，将卵母细胞胚胎放在载体的黑体位置，尽量减少带入VS2(少于1ul), 如果超过2个卵母细胞胚胎，每个卵母细胞胚胎要1滴。看右图。在载体上除去VS将卵母细胞放在载体后，用吸液管将多余的VS液体吸去。将吸液管顶部放在VS液底部将吸液管横向拉开液体，使VS液体降低吸取多余的VS液，尽量减少VS留下，但不能吸去卵母细胞胚胎好样板不好的样板在载体黑色局部有1滴平面VS液体，在载体黑色旁边有立体的VS液滴，VS2太多玻璃化6在显微镜下观察载体上的卵母细胞胚胎是否会有太多的VS液体，快速地将载体放入液氮中。玻璃化7用镊子夹住管帽，将载体尾端插入液氮中，然后用

10、帽盖将载体拧紧。用镊子夹住管帽，将载体插入用手拿着管帽，套好拧紧管帽，确定管帽扣紧载体玻璃化8检查管帽是否拧紧，将载体放入罐子里然后放入储存罐注意：载体纸要一直放在液氮中，直到将其放入储存罐中，当有需要将载体转移到其他储存罐时，其中的时间要将载体放在液氮中，在解冻之前不能将载体暴露在空气中。解冻*第一局部 需要材料玻璃化解冻配套No.1 解冻液TS:1x4mlNo.2 稀释液DS:1x1.5mlNo.3 冲洗液WS:1x1.5mlNo.4 培养皿：TS用35mmNo.5 复制板：6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管型号：MT-150*显微镜关掉加热板*秒表或计算器带计算功能*

11、液氮消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤*镊子*显微针: 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小适宜。卵母细胞内直径：140um，胚胎内直径：140-200um，尽量减少与玻璃解冻液的接触以提高解冻后的成活率。第二局部 解冻准备1. 用培养皿装TS密封放进培养箱37回暖大于1.5小时2. 将DS,WS置于室温内25-273. 取回装有载体的罐子，快速地将罐子插入装满液氮的冷却架中。取回冷却架的罐子，检查载体上标注的病人信息。注意：用体视显微镜放置好冷却架3. 在复制板边上分别写上DS, WS1和WS2. 将1瓶DS和两瓶WS充分混合。用巴斯德管分别取出3

12、00ul 溶液，立刻放进复制板里看右图。将复制板放在显微镜下观察。从培养箱取出TS溶液和培养皿，反转TS两次，使溶液均匀后将全部倒入培养皿中。4.将显微镜重点对准装有TS的培养皿，用巴斯德管确定显微镜对准培养皿正中间。.解冻第三局部 解冻解冻1轻轻地拧开和除去在液氮中的载体管帽，竖立在冷却架的边角。解冻2准备好用巴斯德管将载体固定在液氮中，设置好秒表有计算功能。为以下步骤检查并设定好秒表。解冻3快速地将载体放入在显微镜下的TS，时间应为1秒钟看左下列图。卵母细胞胚胎要在载体黑色局部中间。泡在TS 1分钟，卵母细胞胚胎与载体纸别离后，轻轻地用巴斯德管吸取卵母细胞胚胎，就算卵母细胞胚胎没与载体别离也要将其吸入巴斯德管。同样，吸取TS液，知道卵母细胞胚胎到达巴斯德管顶2mm.第四局部 稀释稀释3分钟慢慢地从巴斯德管将TS液放入DS液 底部，然后慢慢地将卵母细胞胚胎放到DS液 的TS底层。放置3分钟，这个步骤是将卵母细胞胚胎从TS逐渐转移到DS液中。 第五局部 冲洗冲洗1需时5分钟浸泡在DS液中3分钟后，用巴斯德管从DS液中轻轻地吸取卵母细胞胚胎，同时，吸入DS液，直到卵母细胞胚胎离巴斯德管顶2mm。 首先只将巴斯德管里的DS液放入在WS1 底部，然后轻轻地将卵母细胞胚胎放入到WS1底部的DS层里。这个步骤主要是将卵母细胞胚胎逐渐从DS液转移到WS中。冲洗