酵母表达的注意事项

1、1、菌株用GS115表达不出蛋白，换KM71品，大部分克隆能表达。2、温度：在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。3、pH手册上用6.0,pH提高到6.8,不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY勺pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA,最适pH大概5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。4、偏爱密码子codonbias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结

2、构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。5、表达时间与空质粒转化对照诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。6、污染每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2mlBMGY凿菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml,余1ml换2mlBMM诱导表达，3,4层纱布足够了。污染一般都是跟瓶口覆

3、盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。7、不表达蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2-3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。8、表达量30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高510倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。9、糖基化酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：NXS/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1-3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其

4、位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。10、表型与表达重组Sall和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。11、培养基YPD最基本的培养用；BMGY诱导表达前培养用；BMMY诱导表达用；MD电转化后筛选his+用。YEPD是不能代替BMGY勺，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过

5、有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPDf的葡萄糖用3%勺甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。BMGYBMM次菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY寸也没必'要用5%±滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%3醇至你要的浓度。YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPDi化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反

6、应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦熬浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。用无机盐进行大规模发酵，更省钱。大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。一个批次100h左右估计34瓶氧气。关于Tryptone和Peptone的选择：1）用培养

7、E.coli的Tryptone替彳弋Peptone对有些酵母菌可以，例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的AH109,Y187之类表达酵母，根本就长不好.2）Tryptone和Peptone虽然都是营养月东，但营养成分不一样.即使是一般的表达酵母可以在Tryptone生长，生长状态也没有在Peptone中好.但tryptone和peptone就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用peptone的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB3）如果要求不高，一般使用也还凑合.尽可能的用Peptone,difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白月东都可以

8、很正常的培养绝大多数酵母菌.4）用含Peptone的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。而改用Tryptone后，培养基颜色变得很浅，和LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。invitrogen说明书说peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。培养毕赤酵母，书上说BIOTIN储液是水溶液，但事实上BIOTIN很难溶于水，可以稍稍水浴加热一下。配制500XBIOTINstocksolution（0.02%）有这么3种方案：1）、懒人是将Biot

9、in直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2）、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH就很容易溶解了；3）、水浴加热，温度不能高于50度。D生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白陈中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MDMM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）。所以肯定要加的。附：无机培养基配方BSM6机培养基：85%H3PO426.7ml/LCaSO4?2H2O0.93g/LK2SO418.2g/LMgSO4?2H2O14.9g

10、/LKOH4.13g/L甘油40g/LPMT14.0ml/L100%M水调pH5.0（1瓶50ml加800ul氨水）或10g/L硫酸镂调pH5.0,氨水用于上罐调pH（便宜，方便）。诱导表达前调pH6.0opH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HSA融合蛋白的最适pH。BS晒压灭菌后再加4.0ml/L过滤除菌的PTM1（微量元素）4.0ml/L。100%勺500ml甲醇加6mlPMT1,用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。PMT1（1L）配方：CuSO4?5H2O6.0g/LKI0.088g/LMnSO4?H2O3.0g/LNa2MoO4?2H2O0.2g/LH3BO30.0

11、2g/LCoCl2?6H2O0.5g/LZnCl220.0g/LFeSO4?7H2O65.0g/LBiotin0.2g/L浓H2SO45.0ml12、蛋白降解分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，47都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。Severalstrategieshavebeenreportedaseffectiveinminimizin

12、gtheproteolyticinstabilityofspecificforeignproteinssecretedintotheP.pastorisculturemedium.1）、Thefirstisaddingtotheculturemediumofamino-acidrichsupplementsuchaspeptoneorcasaminoacid,whichreduceproductdegradationpossiblybyactingasexecesssubstratesforoneormoreproblemproteases.2）、Thesecondstrategytomini

13、mizeproteolyticdegradationistooptimizetheculturepHbetweenpH3.0andpH7.0.3）、Thethirdstrategyinvolveselevatingthelevelofammoniumintheculturebrothadequately,whichisexplainedbythehypothesisthatporteaseactivityisinducedundernitrogenstarvation.Theforthstrategyislettheculturetemperature28deginsteadof30deg.连

14、续两个或两个以上的碱性氨基酸相邻的结构，如果有的话，在这一位点是很容易被蛋白酶切断，产生偏小的多肽。13、换液通常用BMGYeBMM锵要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGYS加甲醇诱导就行了。GS115在第4天达到了最高表达量。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高，10ml生长培养后，等体积换液。我用250三角瓶，装量25mlBMG您酉22天，再取0.5ml加入BMMY250三角瓶，装量25ml）中诱导发酵.BMG林口BMMY勺换液方式有2种：1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMM毗下菌体，再

15、转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。另外2）一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。总之，无论是取样还是补料、加甲醇，尽量用灭菌的移液管（因为比较长，不容易引起污染）。当然，微量的如200ul,还是用移液器加（快而准确），可以在瓶口处往瓶内加入100%甲醇等。用新开启的分析纯甲醇，我们都没有过滤或者其他处理，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TI

16、P吸取加入摇瓶就可以了。实验室里也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。14、上罐表达放罐时OD能达到400左右，生长过程最高OD50曲右，重组蛋白发酵水平大约300-400mg/L。30g/L甘油初始培养OD勺40左右，流加约420g/L甘油后，菌体密度达到最高约500。开始诱导后，起初3-5h之内流加的甲醇很少，发酵体积变化小，但是菌体的OD值是快速下降的，一般是原来的90%£右，每次都是这样，确切原因我们也还不清楚，估计是酵母从高速生长转向营养饥饿过程中，菌体形态发生很大变化，比如大小、含水量、折光率等。随酵母逐渐适应利用甲醇为碳源，mut+型酵母的诱导可以将甲醇的流速逐步提高，此

17、时仍然能发现OD值下降，我们认为这主要是发酵体积增加的原因造成的。我们诱导过程一般增加约40%的体积7L到10L,最终OD直约为最高OD直白80%£右，简单换算一下，应该知道菌体生物量增加约1/7。其实，这和毕赤酵母代谢甲醇途径也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分继续氧化成甲酸进而生成CO2产生菌体所需的能量，另一部分可以被菌体同化，进入小分子碳架的合成途径，提供菌体生长所需的碳源。15、菌体密度：菌体是在BMM件培养的，可以不用BMM做对照，在600nm处测OD直，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12

18、,诱导培养结束后，密度可达到18左右。如果用1体积的BMGY在生长阶段结束后，换液时，加入1/101/2体积的BMMY®行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。17、菌种保存用15%t油做保护剂，-70度长期保存，-20度短期保存使用。不过要注意冻存前一定充分混匀，酵母菌体很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。一般OD2-6的YPD过夜菌吸取300ul菌液到灭菌的

19、EP管然后加等体积的甘油，混匀，放于20度.保存长的话最好放8。度冰箱。重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。这在用动物细胞表达系统如CHONS0系统更为明显，所以一定要保存好最原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆表达，尽量减少菌株传代次数。不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株。GS115的鉴定方法接种GS115于5mlYPD夜体培养基，30C,200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30c培养48小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4c保存。GS115的his4基因突变了，不能在

20、组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含基本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB±不长的是GS115这样能挑到纯的，以防突变。附：TCA沉淀方法；ELISAprotocol;原位双膜法快速检测阳性表达株:TCA沉淀方法培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳，。表达上清很少有直接考染能看得到条带的，1ml表达上清浓缩到20ul直接电泳。一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带，但重复性不好。具体步骤：1 .菌液10000g，离心5分钟

21、，收集表达上清。2 .取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100%TCA颠倒10次混匀。3 .样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。4.15000g,离心1020分钟，可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。5.将EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱1020分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风，关键是除去管底和管壁残余液体。6.15000g,离心1020分钟，用20ul枪头尽量吸去管底残余的液体，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回U率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉

22、淀。7 .EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。8 .加入20-50ulLoadingbuffer,95度加热10nim,一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余TCA如果蓝色的Loadingbuffer不变成黄色，说明残余TCA吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了，而且不影响电泳效果。或者第5步和第6步改为丙酮洗：5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA6.15000g,离心1020分钟，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻

23、轻控几下，除去残余在管Loadingbuffer溶解蛋白沉淀，始终不能溶解，Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，颜色比较少，一般用丙酮洗一步后很好溶。沉淀不溶,口的液体。样品是酵母细胞超声后离心获得的上清，用而且加热超过10分钟以后也依旧不溶解。是绿的，不好溶，Peptone沉淀是黑色的,很可能是TCA没有除干净）ELISAprotocol用BMM格养基一般表达12天收集表达上清，稀释一定比例铺板做ELISA检测1 .取510ulBMMY表达上清用0.05MNaHCO3稀释到100ul铺ELISA板，37度或室温振荡大于1小时。注意一定要做一个GS115空菌株表达上清作为阴性对照，最

24、好还找一个带有histag的蛋白作为阳性对照。2 .TPBS洗板3次，方法：倒掉铺板液，倒置于毛巾上轻轻拍打几次，力口TPBS至满，重复。3 .加封闭液（TPBS力口1%脱脂奶粉）350ml/孔，室温下放置40分钟一1小时，TPBSc3次。4 .加封闭液稀释的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.51小时，TPBSc3次。很多公司都有histag的单抗，个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1:1000-5000稀释，不同公司的抗体效价不同。5 .加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.51小时，TPBS洗3次。二抗很多公司有，国产的华美都可以，1:500-10000如果是HRP标记的histag抗体，不加二抗直接显色。6 .加入OPD显色液100ul/孔，避光反应约1030分钟。显色液配方：1