抗体库技术PPT课件

1、新乡医学院免疫学教研室Niels K. JerneGeorges J.F. KhlerCsar Milstein丹麦CAntigenBADBCADabcdAntibody aAntibody bAntibody cAntibody d多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备基因工程抗体技术2020世纪世纪8080年代年代, DNA, DNA重组技术重组技术发展发展使制备部分或全部人源化的基因工程抗体基因工程抗体成为成为可能，因此可能，因此产生了产生了基因工程抗体技术基因工程抗体技术。第一节第一节 抗体库技术抗体库技术进入进入2020世纪世纪9090年代，组合化学技术与基

2、因工程年代，组合化学技术与基因工程抗体技术相互结合产生了抗体技术相互结合产生了抗体库技术抗体库技术。从此抗。从此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。体工程技术进入了一个新的发展阶段。抗体库技术的产生基于两项关键技术的突破抗体库技术的产生基于两项关键技术的突破：PCRPCR技术技术的出现和发展使人们能够使用一套的出现和发展使人们能够使用一套引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因; ;利利用用大肠杆菌成功表达出大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗具有抗原结合功能的抗体分子片段。体分子片段。 概概 念念所谓所谓抗体库抗体库( (antibody library) )技

3、术技术, ,就是就是用基因克隆技术用基因克隆技术克隆克隆全套抗体重链和轻全套抗体重链和轻链可变区基因链可变区基因, ,然后然后重组重组到特定的原核表到特定的原核表达载体中达载体中, ,再再转化转化大肠杆菌以大肠杆菌以表达表达有功能有功能的抗体分子片段的抗体分子片段, ,并通过并通过亲和筛选亲和筛选获得特获得特异性抗体可变区基因的技术异性抗体可变区基因的技术。 抗体库技术经历了抗体库技术经历了组合抗体库、噬组合抗体库、噬菌体抗体库、核糖体展示菌体抗体库、核糖体展示(ribosome (ribosome display)display)抗体库抗体库3 3个发展阶段个发展阶段。 英英国剑桥的国剑桥的

4、WardWard等最等最早尝试早尝试了抗体库的了抗体库的构建构建，他们用他们用PCRPCR从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNADNA扩扩增出增出VHVH基因基因, ,测序证实了其多样性测序证实了其多样性, ,在大肠杆菌在大肠杆菌表达出表达出VHVH段段( (单区抗体单区抗体),),检测检测20002000个克隆得到个克隆得到2121个可以与溶菌酶特异结合的克隆个可以与溶菌酶特异结合的克隆。这一工作未构建完整的抗原结合部位这一工作未构建完整的抗原结合部位( (无轻链无轻链),),也未提出有效的筛选方法也未提出有效的筛选方法, ,但它表明了抗体库但它表明了抗体库技术的可行性技

5、术的可行性。 2 2个月之后个月之后，ScienceScience上发表了美国上发表了美国ScScririppspps研究所研究所HuseHuse等的完整的抗体库工等的完整的抗体库工作作, ,他们用逆转录他们用逆转录-PCR-PCR技术从淋巴细胞克技术从淋巴细胞克隆出抗体轻链基因隆出抗体轻链基因repertoirerepertoire和重链和重链FdFd段基因段基因repertoirerepertoire, ,将两者分别组建到噬将两者分别组建到噬菌体表达载体中菌体表达载体中（如下图）（如下图）。组合抗体库组合抗体库的表达载体的表达载体Fab=VL+CL (L) VH+CH1(Fd)Fab片段结

6、合抗原Fc=CH2+CH3A：重链载体：重链载体 B：轻链载体：轻链载体 C：组合后的：组合后的Fab段表达载体段表达载体抗体库技术抗体库技术较细胞融合杂交瘤技术较细胞融合杂交瘤技术制备单抗有着明显的优越性制备单抗有着明显的优越性： 1.抗体库技术省去了细胞融合的步骤抗体库技术省去了细胞融合的步骤,省时省力省时省力,避免了避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。2.扩大了筛选容量扩大了筛选容量,用杂交瘤技术一般筛选能力在上千用杂交瘤技术一般筛选能力在上千个克隆以内个克隆以内,而抗体库可筛选而抗体库可筛选106以上个克隆以上个克隆。3.抗体库技术直

7、接得到抗体的基因抗体库技术直接得到抗体的基因,既既无杂交瘤丢失之无杂交瘤丢失之虞虞,又便于进一步构建各种基因工程抗体又便于进一步构建各种基因工程抗体。4.抗体库技术得到的抗体可以在大肠杆菌表达抗体库技术得到的抗体可以在大肠杆菌表达,可利用可利用原核表达系统的优势原核表达系统的优势。5.一些难于制备的抗体一些难于制备的抗体,如针对弱免疫原、毒性抗原的如针对弱免疫原、毒性抗原的抗体抗体,以及以及人源抗体人源抗体的制备可以得到解决的制备可以得到解决。组合抗体库技术出现后不到一年组合抗体库技术出现后不到一年, , 即被即被噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术所代替所代替, , 该技术是在该技术是在噬菌体表

8、面展示噬菌体表面展示(phage display)(phage display)技术基技术基础上建立起来的础上建立起来的, , 是迄今为止发展最成是迄今为止发展最成熟熟、应用最为广泛的抗体库技术。应用最为广泛的抗体库技术。 1985年年Smith 证实噬菌体证实噬菌体fd基因组能通过基因工基因组能通过基因工程的手段进行改造。程的手段进行改造。1988年年Parmley 将已知抗原决定簇与噬菌体将已知抗原决定簇与噬菌体P N端融合呈现在其表面。端融合呈现在其表面。1990年年McCafferty 用噬菌体展示技术筛选溶菌酶用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的

9、单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代。的时代。一系列噬菌体文库的构建一系列噬菌体文库的构建噬菌体展示技术焕发出了噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。新的生命力。第二节第二节 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术一一、在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。Phage Display of PeptidesSelection From Library of Random MutantsRandom Library ofDNA SequencesGene 3 or 8+Gene 3 Fusions

10、Each Phage DisplaysOne Peptide SequenceTranslated from DNA to Peptide in E. coli非展示系统 展示系统 噬菌体展示技术最关键的优势有三：噬菌体展示技术最关键的优势有三：第 一 ： 淘 选 的 高 效 率 使 得 在 极 低 的 存 在第 一 ： 淘 选 的 高 效 率 使 得 在 极 低 的 存 在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能可能；第二：所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况第二：所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到下，通过感染细菌得到富集富集；第三：展示的多肽

11、或蛋白质与其包含在噬菌体第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列的序列分析既快速又简便分析既快速又简便。二、噬菌体抗体库的构建二、噬菌体抗体库的构建噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术(phage display antibody library techniques) 是指用聚合酶链反应是指用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR) 扩增抗体的扩增抗体的全套可变区基因全套可变区基因,通过噬菌体表面展示技术通过噬菌体表面展示技术,把把Fab 段或单链抗体段或单链抗体(ScFv)

12、 表达在噬菌体的表面表达在噬菌体的表面,经过经过“吸附吸附-洗脱洗脱-扩增扩增”过程筛选并富集特过程筛选并富集特异性抗体。异性抗体。构建构建Fab抗体库和抗体库和ScFv抗体库的差别抗体库的差别页页VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab)2FabFcMembraneExtensionAntibody IgG structureVHVLCLCH1CH2CH3FvFvVHVLscFvVHVLSingle Chain Fragment variableSingle Chain Fragment variable免疫球蛋白基因可来源杂交瘤细胞体外免疫的细胞致敏及非致敏的B 淋巴细胞(骨髓、外

13、周血)病灶局部引流淋巴结扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等其中以淋巴结的B 淋巴细胞较好单链抗体单链抗体(ScFv) 表达在噬菌体的表面表达在噬菌体的表面 表达载体表达载体噬菌体抗体库的表达载体可分为 噬菌体(phage) 、单链丝状噬菌体(filamentous phage) 及噬菌粒(phagemid) 三种系统噬菌粒是应用最多的表达载体,也是简便高效模拟B 细胞产生抗体的原核表达系统。Antibody Gene IsolationAntibody binding specificities are defined by the variable regions of the heavy (VH

14、) and light chains (VL). The DNA encoding the VH and VL genes are amplified by PCR from human B lymphocytes and are joined together by DNA encoding a flexible peptide linker. This combinatorial assembly creates a whole repertoire of antibody genes encoding many different antibody fragments in the fo

15、rm of single chain Fvs (scFvs). Phage display vector & Library GenerationThe population of antibody scFv genes are cloned in a phage display vector to create a fusion with the phage coat protein. In this way a library is created in bacteria经典的筛选方法有两种经典的筛选方法有两种290290页页一是将纯抗原包被在固相介质上,如酶标板、免疫试管或亲和层

16、析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体。（固相筛选）二是将抗原与生物素基团相连,再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。（液相筛选）三、噬菌体抗体库技术优势三、噬菌体抗体库技术优势（一）能模拟天然抗体库（一）能模拟天然抗体库,不需要免疫人和动物不需要免疫人和动物在噬菌体抗体库中在噬菌体抗体库中, 含有人抗体各种基因信息含有人抗体各种基因信息的全部的全部mRNA ,为全套抗体基因的获得提供了为全套抗体基因的获得提供了良好材料。良好材料。构建噬菌体抗体库时构建噬菌体抗体库时,抗体重链基因和轻链基因抗体重链基因和轻链基因在体外的重组在体外的重组,

17、造成重、轻链间的配对具有很大造成重、轻链间的配对具有很大的随机性的随机性, 一般认为一般认为,107个特异性抗体分子就个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的能识别全部抗原决定簇的99 %。因此。因此,构建一构建一个库容量为个库容量为108的组合噬菌体抗体库的组合噬菌体抗体库,理论上认理论上认为基本上包括了所有的抗体分子。为基本上包括了所有的抗体分子。（二）适应于大规模工业化生产适应于大规模工业化生产DNA 操作是在细菌中增殖操作是在细菌中增殖,比杂交瘤技术比杂交瘤技术简单快速简单快速,制备单抗从取脾细胞到稳定的制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株至少需要数月克隆株至少需要数月,而噬菌体抗体库技而

18、噬菌体抗体库技术最短只需几周的时间术最短只需几周的时间。（三）可获得不同亲和力的抗体可获得不同亲和力的抗体在构建噬菌体抗体库时在构建噬菌体抗体库时,抗体重链与轻链抗体重链与轻链基因的重组基因的重组,就模拟了机体内抗体亲和力就模拟了机体内抗体亲和力的成熟过程。在噬菌体抗体库中的成熟过程。在噬菌体抗体库中,抗体重抗体重链与轻链间的配对存在着很大的随意性链与轻链间的配对存在着很大的随意性,这往往能改变这往往能改变B 细胞中原有的抗体重、细胞中原有的抗体重、轻链间的配对方式轻链间的配对方式,产生出不同亲和力的产生出不同亲和力的抗体。抗体。四、噬菌体抗体库的应用噬菌体抗体库的应用研制疫苗和诊断试剂研制疫

19、苗和诊断试剂 有学者用乙肝病人的阳性血清中的抗体从噬菌体随机肽库中分离到乙肝病毒特异性的噬菌体模拟肽；Lundin 等对HIV-1 病毒也做了相应的研究,从噬菌体抗体库中分离到能够诱发针对HIV-1 的免疫反应的噬菌体肽。表位研究表位研究确定核酸结合蛋白确定核酸结合蛋白 通过构建锌指的随机肽库,采用核酸作为靶分子进行筛选,可以得到其相应的结合蛋白。药物开发药物开发 利用噬菌体肽库的多样性,筛选出能同受体特异结合的重组噬菌体多肽，可作为受体的激动剂或拮抗剂。基因治疗基因治疗 有学者将呼吸道内皮细胞暴露于随机肽库中,筛选出与之相结合的高亲和力的肽分子,分离相应基因,以重组腺病毒作为载体将外源基因导

20、入呼吸道内皮细胞内,使外源基因得到高效表达,治疗效果明显。 单克隆抗体单克隆抗体 噬菌体抗体噬菌体抗体 杂交瘤技术杂交瘤技术 展示技术展示技术宿主细胞宿主细胞: 杂交瘤杂交瘤 细菌细菌筛选范围筛选范围 : 103 107 109时间时间: 几个月几个月 几周几周操作操作: 繁杂繁杂 相对简单相对简单免疫免疫: 必须必须 可避免可避免人源抗体人源抗体: +费用费用: 高高 低低生产量生产量: 有限有限 无限无限基因获取基因获取: 再克隆再克隆 直接直接应用前景应用前景: 有限有限 不可估不可估 前前 景景第三节第三节 选择性感染噬菌体选择性感染噬菌体展示抗体库技术展示抗体库技术选择性感染噬菌体展

21、示选择性感染噬菌体展示(selectively (selectively infective phage display)infective phage display)技术即技术即SIPSIP技技术术, ,是在噬菌体展示技术的基础上发展起是在噬菌体展示技术的基础上发展起来的。该技术通过来的。该技术通过将候选蛋白与配体之将候选蛋白与配体之间的结合反应与噬菌体感染和扩增直接间的结合反应与噬菌体感染和扩增直接联系起来联系起来, ,不必经过亲和筛选与洗脱不必经过亲和筛选与洗脱, ,直直接获得特异性候选蛋白基因。接获得特异性候选蛋白基因。 一、选择性感染噬菌体展示一、选择性感染噬菌体展示SIP技术的原

22、理技术的原理 294页页将筛选将筛选配体配体与与N1、N2复合物化学偶联作为接头，与复合物化学偶联作为接头，与gIII融合蛋白融合蛋白特异特异性结合，重组噬菌体恢复感染大肠杆菌的能力性结合，重组噬菌体恢复感染大肠杆菌的能力gIII蛋白蛋白N1结构域结构域 N2结构域结构域 CT结构域结构域a体内体内SIP b体外体外SIP 295页页经过一轮经过一轮SIP筛选之后筛选之后,就可以捕获到紧密结合就可以捕获到紧密结合的配体结合分子；而且经过几轮筛选之后的配体结合分子；而且经过几轮筛选之后,还还可以富集具有最佳结合活性和最佳折叠活性的可以富集具有最佳结合活性和最佳折叠活性的配体结合分子。配体结合分子

23、。但是但是SIP技术本身还存在一定的缺陷。例如在技术本身还存在一定的缺陷。例如在进行体内进行体内SIP筛选时筛选时,由于配体接头与候选蛋白由于配体接头与候选蛋白之间有可能形成伪二硫键桥之间有可能形成伪二硫键桥,或者在特定条件或者在特定条件下下(尽管出现几率很低尽管出现几率很低),由于噬菌体发生的一系由于噬菌体发生的一系列的遗传重组列的遗传重组,恢复了恢复了N1/N2结构域与结构域与CT结构结构域之间的某种共价连接域之间的某种共价连接,从而导致非特异筛选从而导致非特异筛选。第四节第四节 核糖体展示抗体库技术核糖体展示抗体库技术 以以噬菌体展示抗体库技术噬菌体展示抗体库技术和和SIP抗体库技术抗体库技术为代表的为代表的体内筛选抗体库技术体内筛选抗体库技术具有一些共同缺点具有一些共同缺点。在构建抗体库时在构建抗体库时,由于必须经过细菌转化的步骤由于必须经过细菌转化的步骤,抗体库抗体库