产前无创检测

1、详解无创产前检测日期:2016-03-31 11:39:02 来源: 检验时间 点击:322 次无创产前检测（NIPT）越来越受到大家的重视，检验科在无创产前检测方面的工作也越来越多。什么是无创产前检测？1997 年香港中文大学的卢煜明（Dennis L）教授发现在母体外周血浆中存在胎儿游离 DNA。这种胎儿游离 DNA 来自于胎盘滋养层细胞，在怀孕后 5 周就可检测到，怀孕 10 周后，胎儿游离 DNA 占外周血游离 DNA 3%13%，并随着孕周的增长而增加，直到分娩后 2 小时消失。因此，通过采集孕妇静脉血，利用高通量 DNA 测序技术对母体外周血浆中的游离

2、 DNA 片段（包含胎儿游离 DNA）进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，可以从中得到胎儿的遗传信息，从而检测胎儿是否患非整倍体染色体疾病。无创产前检测的原理无创产前检测首先需要提取母体外周血浆中的游离 DNA，然后对这些游离 DNA 进行高通量的测序，通过生物信息比对的方法将测得的 DNA 序列定位到相应的染色体上。每个 DNA 序列都有一个唯一的对应位置，然后计算出测定的 DNA 序列被分配到每条染色体的具体比例数值。当测序量足够高（每个样本测定 1000 万条以上的序列），每条染色体的比例数值在一个非常固定的范围内，其变异系数（CV）不会超过 1%。因此可以根据每个染色体的比例数值是

3、否偏离标准量，来推断胎儿染色体是否为非整倍体。为了获得足够的统计效力，一般设定 3 倍的标准差作为阳性 cutoff 值，通过 Z 检验计算测定出的染色体比例数值的偏移量，Z 的 cutoff 值为 3，当 Z 大于 3 时就意味着有 99.9% 的效力可确定为阳性标本。上述检测原理比较难懂，我们以 21-三体为例通俗地讲一下无创产前检测的原理：正常母亲及胎儿的 21 号染色体均为 2 倍体，而 21-三体胎儿其 21 号染色体为 3 倍体，我们假定胎儿游离 DNA 占 20%，母体游离 DNA 占 80%，有 10 份拷贝的游离 DNA 通过生物信息比对定位到了 21 号染色体，对于正常胎儿

4、来说 10 份游离 DNA 中 2 份来自胎儿，8 份来自母体。而对怀有 21-三体胎儿的孕妇来说，由于 21 号染色体是 3 倍体，外周血中来源于 21 号染色体的游离 DNA 有 11 份，3 份来自胎儿，8 份来自母体。此时，怀有 21-三体胎儿和正常胎儿的母体血浆 21 号染色体游离 DNA 的比例就是 11：10，远远超出了正常的比例范围。无创产前检测可以检测哪些染色体异常理论上讲无创产前检测可以检测出所有的染色体非整倍体，最常见的是 21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征和性染色体多倍体。与传统筛查技术相比，无创产前筛查具有更高的敏感性和特异性，对 21-三体综合征、

5、18-三体综合征、13-三体综合征和性染色体多倍体的筛查敏感性分别为 99.3%、97.4%、91.6% 和 91%，而假阳性率仅有 0.2%、0.2%、0.1% 和 0.4%。但无创产前检测不能筛查出神经管缺陷，因此无创产前检测并不能完全取代现有的产前筛查方法，进行了无创产前检测的孕妇，仍然需要筛查神经管缺陷。哪些人群需要进行无创产前检测？根据美国妇产科学会及美国母胎医学会共同发表的 545 号委员会意见，建议以下五种人群可以考虑接受 NIPT：1. 分娩时母亲年龄大于等于 35 岁2. 超声结果显示胎儿非整倍体风险增高3. 曾经生育过三体患儿4. 筛查结果为非整倍体高危（包括早孕期筛查，中

6、孕期筛查，序贯筛查或者整合筛查或者四联筛查）5. 父母为平衡罗伯逊易位（Robertsonian translocation）具有 13-三体和 21-三体高风险哪些人不适合做无创产前检测1. 孕 24 周以上的孕妇2. 多胎孕妇3. 孕妇有染色体疾病或携带异常染色体4. 接受过外源输血、器官移植、干细胞治疗的孕妇怀孕的什么时间进行无创产前检测无创产前检测最佳检测时间是 12-22+6 孕周，如果检测过早（12 周前）会因母体外周血中的胎儿游离 DNA 含量过低而达不到要求。虽然胎儿游离 DNA 会一直存在于母体外周血中直到分娩，但如在晚于 22+6 孕周检测，如果检测阳性会错过介入性产前诊断

7、的最佳时间，而且考虑到伦理因素，不建议在 22+6 孕周进行无创产前检测。无创产前检测的优势1. 简单： 仅需母体外周静脉血 5-10 ml，无需空腹2. 无创伤性：无需介入性检测，不会造成感染及流产，可以缓解孕妇及家属的心理负担3. 灵敏度及特异性高4. 孕早期既可以检测尽管无创产前检测具有极高的敏感性及特异性，但它仍然是一项筛查技术，不能取代介入性产前诊断，阳性孕妇需要进一步的产前诊断。什么是胎儿染色体异常筛查？日期:2016-03-29 16:34:03 来源:中华检验医学网 点击:366 次2011 年卫生部颁布的胎儿常见染色体异常与开放性神经管

8、缺陷的产前筛查与诊断技术标准中给出的定义是：通过简便、经济和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现某些有先天性缺陷和遗传疾病胎儿的高风险孕妇，以便进一步明确诊断。胎儿染色体异常筛查主要通过孕妇血清标志物，胎儿体表及重要脏器超声筛查发现高风险孕妇，以便进行后续的诊断性检查。通过这些筛查可以发现 21- 三体、18- 三体、13- 三体及神经管缺陷胎儿。染色体异常筛查有几类？早孕期筛查（First Trimester Screening）：在 1013+6 周进行，主要是 PAPP-A 和 

9、-hCG 两种血清标志物联合应用的二联筛查方法及胎儿颈项透明层（NT）厚度测定。其中唐氏综合征患儿母体 PAPP-A 浓度会降低（平均为 0.43 MoM），-hCG 浓度会升高（平均为 1.98 MoM）。中孕期筛查（Second Trimester Screening）：在 1520+6 周进行，主要有 AFP、-hCG 和E3 三种血清标志物联合应用的三联筛查方法及 AFP、-hCG、E3 和 Inhibin-

10、A 四种血清标志物联合应用的四联筛查方法。其中唐氏综合征患儿母体 AFP 和E3 浓度会降低（平均水平分别为 0.74 MoM 和 0.75 MoM），-hCG 和 Inhibin-A 浓度会升高（平均水平分别为 2.06 MoM 和 1.77 MoM）；中孕期筛查是在我国应用最广泛的是筛查方法，也是卫生部标准中给出的筛查方法。整合筛查（Integrated Screening）：即孕早期筛查 + 

11、;孕中期筛查，最终得出一个风险值，根据风险值判断是否进行产前诊断，主要包括：血清学整合筛查和全面整合筛查（血清学整合筛查 +NT）。序贯筛查（Sequential Screening）：序贯筛查有两种方式：一是分段序贯筛查（Stepwise Sequential Screening）即先进行早孕期筛查，得出早孕期风险值，高危者建议行产前诊断，低危者至中孕期接受中孕期筛查，最后根据早中孕期筛查结果进行综合风险分析；二是酌情序贯筛查（Contingent Sequential Screening），即早孕期筛查后，将筛查人群分为三类，风险

12、值大于 1/60 的进行产前诊断；风险值小于 1/1000 的无需进行孕中期筛查仅常规体检，而介于两者之间的孕妇至中孕期筛查后，综合判断是否进行产前诊断。序贯筛查与整合筛查的区别是，前者在早孕期筛查后有风险评估，根据风险度决定是否接受孕中期筛查，而后者中间无风险评估，直接进行中孕期筛查，根据两次筛查结果进行风险度评估。各种筛查方法的检出率根据文献报道，各种不同筛查方法的检出率见下表：筛查人群及如何选择筛查项目当孕妇年龄超过三十五岁后，染色体异常婴儿出生的几率大大升高，因此卫生部颁布的胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准中规定中孕期

13、母血清学产前筛查适用于年龄在 35 岁以下的中孕期孕妇进行筛查。但现在越来越多的观点认为，虽然 35 岁以上孕妇染色体异常婴儿出生的几率比较高，但 35 岁以上产妇所生染色体异常婴儿占所有染色体异常婴儿的比例并不高，因此所有孕妇都应该在怀孕 20 周之前参加筛查，无论年龄的大小。在选择采取何种筛选项目前，应该让病人充分了解各种筛选方法的假阳性率及检出率、优缺点、局限性以及诊断项目的风险和收益。选择何种筛选程序取决于多个因素，包括：首次进行产前检查时的孕周、单胎双胎还是多胎、家族史、既往孕产史、是否有 NT

14、 测量条件、筛查试验的敏感性及局限性、侵入性诊断试验的风险性，是否愿意接受孕早期筛查以及是否愿意提前终止妊娠等。在可能的情况下尽量选择检出率高假阳性率低的筛查项目（如整合筛查或序贯筛查），特别是不具备诊断试验条件的情况下。与诊断试验相比筛查试验的优缺点筛查试验的优点是可以发现唐氏综合症、21- 三体综合征和 18- 三体综合征的高风险人群。筛查阳性人群在进行诊断试验阳性率比不参加筛查试验的人群高，经过筛查可以减少侵入性诊断试验的数量，减少因此造成的流产等不良后果。筛查试验最重要的缺点是检出率不是 100%，孕妇和医生应该明白筛查试验提供的是风险

15、度而不是诊断性结果，不能检测出所有的染色体异常。而且由于假阳性的存在，会增加筛查假阳性孕妇的心理负担。相比而言诊断性试验可以检测出所有的染色体三体、并可以可靠检测出性染色体非整倍体、大段的染色体插入与缺失。但由于是侵入性检查，可能会对母体及胎儿造成危害。无创产前筛查（Noninvasive Prenatal Screening）无创产前筛查是通过对孕妇血浆中的游离 DNA 进行高通量测序，从而对染色体异常胎儿进行筛查的一项新兴技术。孕妇血浆中的游离 DNA 是一组混合 DNA，孕 10 周后，其中

16、0;3%13% 的 DNA 来自于胎儿。无创产前筛查仅能筛出三体综合征及性染色体异常，适用人群包括：35 岁及以上年龄孕妇、超声筛查高危孕妇、有染色体异常婴儿孕产史的孕妇、有染色体异常家族史的孕妇以及血清筛查高危孕妇。与传统筛查技术相比，无创产前筛查具有更高的敏感性和特异性，对 21- 三体综合征、18- 三体综合征、13- 三体综合征和性染色体多倍体的筛查敏感性分别为 99.3%、97.4%、91.6% 和 91%，而假阳性率仅有 0.2%、0.2%、0.1% 和

17、 0.4%。目前多个国家已将其列入筛查指南中，但需要注意的是无创产前筛查仍然是一种筛查方法，不能取代诊断性试验 怀孕生孩子那些事 之 唐氏筛查Vs无创胎儿DNA检查Vs羊穿的纠结日期:2016-03-24 19:57:54 来源: 段涛大夫 点击:365 次怀孕以后每个孕妇都会遇到的一个纠结就是唐氏综合征的筛查与诊断，这也是孕期一个最大的纠结点，经常会在门诊遇到一些准妈妈和老公为此商量很久还是下不了决心。选择越多，纠结也就越多。单单是筛查就有早孕期筛查，中孕期筛查，早中孕期联合筛查，二联，三联或四联筛查，在早中孕期联合筛查方案中还有Integr

18、ated, Continuous Combined, Contingent, Sequential各种组合，除了血清学指标以外，还可以再加上超声软指标的检查。现在又多了一个筛查NIPT（无创胎儿DNA检测），当然还可以直接选择羊膜腔穿刺。每一种方法都有自己相应的适应证，禁忌证，以及优缺点，没有一种方法是完美的，所以才会有纠结，所以才会有选择障碍。为了让大家减少选择障碍，特地将“唐筛”，“无创”，“羊穿”比较如下，仅供参考。如果看了这篇文章还是犹豫不决的话，你基本上是离“选择障碍”不远了。如何对付“选择障碍”？请参阅我之前发表的文章“怀孕生孩子那些事  之  选择障碍”。&#

19、160;唐氏筛查所谓的唐氏筛查就是在早中孕期抽取母亲的外周血，测定相应的生化标志物，综合孕周、孕妇年龄、体重等各项信息，经过专业的筛查软件，计算出胎儿有染色体异常的风险。在唐氏筛查方案中，有单独的血清学筛查方案（Serum only），还有血清学筛查再加上超声软标志物的联合方案。例如“早唐”就是在早孕期抽取母亲的外周血测定相应的指标，再测量胎儿的NT（颈项透明层），最终计算出胎儿有染色体异常的风险。如果风险值超过设定的切割值（例如1/270），就被定义为高风险，医生一般会建议你进行羊膜腔穿刺。低风险一般不需要进行羊膜腔穿刺，但是请注意，低风险并不是“没风险”，只是说胎儿有染色体异常的风险小于普

20、通人群，胎儿依然有一定的染色体异常的风险，只是风险比较小而已。优点：（1）仅需抽取孕妇外周血，无需穿刺，对胎儿及孕妇没有创伤；（2）价格低廉，一般为150-300元；（3）孕妇某些血清学指标不仅能预测21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征及神经管缺陷的风险，对于性染色体异常和结构异常、以及某些妊娠并发症（例如子痫前期）的早期预测还有一定的价值。局限性：（1）对孕周有严格要求：早唐11-13周6天，中唐14-20周；（2）仅针对21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征及神经管缺陷计算患病风险，对于其他的染色体数目和结构异常无法给出具体的风险值；（3）预期的染色体异常检出

21、率为60-90%，假阳性率为3.5-8%（因筛查策略不同而异）；（4）筛查不等于确诊，若筛查结果提示高风险，需进一步进行产前诊断，若提示低风险，不代表胎儿完全正常；早唐的适应证：所有单胎、双胎妊娠孕妇均可以做早唐。但对于多胎（三胎妊娠或以上）孕妇或多胎一胎胎死宫内，此时可行NT检查，但不做血清学筛查。对于高龄产妇也鼓励做早唐，因为NT检测的意义不仅仅可以评估染色体异常的风险，还可评估胎儿发生大结构畸形（如心脏畸形、隔疝等）、遗传综合征等的风险。但需告知筛查并非诊断，对于高龄产妇，即使早唐风险低危，仍需考虑行产前诊断。中唐适应证：年龄小于35岁（指到了预产期时孕妇的年龄）的单胎妊娠孕妇。

22、0;无创性胎儿染色体非整倍体检测（NIPT）NIPT是通过采集孕妇外周血，提取游离的来自胎儿的DNA，采用新一代高通量测序结合生物信息学分析，得出胎儿患染色体非整倍体疾病的风险率。优点：（1）仅需抽取孕妇外周血，无需穿刺，对胎儿及孕妇没有创伤；（2）检测的孕周范围较大：12-24周。（3）预期检出率远远高于唐氏筛查：对21三体，18三体，13三体的检出率均高于99%，假阳性率低于1%，一般为0.05%左右，是属于“高级筛查”。局限性：（1）仅针对21-三体综合征，18-三体综合征和13-三体综合征三种染色体疾病；（2）对其他染色体的数目异常及染色体中的嵌合体型、易位型等结构异常无法诊断；（3）

23、价格一般在2000-3000元，是唐氏筛查的10倍，做为筛查手段的一种，价格相对昂贵。（4）虽然检出率很高，但是依然是产前筛查的一种技术手段，不能做为产前最终诊断。适应证：产前筛查（包括血清筛查，或超声遗传标记物的筛查）临界高风险孕妇（如风险率在1/270-1/1000）；有介入性产前诊断禁忌证者（先兆流产、发热、出血倾向、感染未愈等）；珍贵儿妊娠，知情后拒绝介入性产前诊断的孕妇；对介入性产前诊断极度焦虑的孕妇；无法预约到产前诊断的孕妇；35-40岁孕妇，拒绝有创的产前诊断;健康年轻孕妇，唐氏筛查高风险，在1/270-1/50之间；双胎妊娠做无创DNA最好同时结合早孕期NT筛查结果。以下情况不

24、推荐无创性DNA检查：唐氏筛查高风险大于1/50；产前B超检测异常的孕妇，包括早孕颈项透明层厚度大于3.5mm, 早中孕超声发现任何胎儿大结构异常，羊水量的异常，严重的胎儿宫内生长受限等,三胎及以上妊娠,夫妇双方之一有明确染色体结构或数目异常的孕妇；胎儿疑有微缺失综合征、其他染色体异常或基因病的孕妇；接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗、免疫治疗的孕妇。 有创性胎儿染色体检测通过羊膜腔穿刺术（羊穿）或绒毛穿刺术或脐带血穿刺术，获取胎儿细胞，进行细胞培养和染色体核型分析，其中应用最多的还是羊穿。优点：（1）能检测所有的染色体数目异常和大片段的染色体结构异常；（2）是目前胎儿染色体疾病产

25、前诊断的“金标准”。局限性：（1）一般情况下，穿刺术是比较安全的，但仍存在个别穿刺失败、引起流产、感染、羊水渗漏的风险，羊穿的总体胎儿流失率大约为0.5%；（2）细胞培养存在个体差异，不能确保100%成功；（3）染色体检测对于染色体微小结构改变、单基因遗传病、多基因遗传病、环境和药物导致的胎儿宫内发育异常；低比例嵌合以及母体污染不能完全排除。羊穿适应证：母体年龄35岁；产前筛查提示胎儿染色体异常高风险；既往有胎儿染色体异常的不良孕产史；产前检查怀疑胎儿患染色体病的孕妇；夫妇一方为染色体异常携带者；孕妇可能为某种X连锁遗传病基因携带者；曾有不良孕产史或特殊致畸因子接触史者。近些年有人主张将ICS

26、I（胞浆内单精子注射）也列入羊穿指征。   结  论  ·早唐比中唐检出率高··无创比唐筛检出率高··羊穿的检出率最高··筛查低风险并不意味着没有风险··筛查高风险羊穿后绝大多数结果是正常的··唐筛除了能筛查21三体，18三体，13三体异常外，还能额外筛查出部分的性染色体异常和染色体结构异常，以及神经管缺陷··无创筛查阳性，依然需要进行羊穿确诊··筛查无风险，羊穿有比较低的，可控的，可接受的风险·

27、PS：什么？还是没看懂？好吧，你就果断取关吧，我不是你的菜！看完了还是纠结？好吧，你就别做决定了，让你老公或让你妈做决定吧！本以为女人作出正确选择的能力是非常强的，因为女人可以很快在几百种甚至上千种不同款式、颜色和价格的鞋子中选出她真正喜欢和需要的，这是一种多么伟大的能力啊！与之相比，不同的唐氏筛查方案的选择简直就是小菜一碟！可为什么还是会这么纠结呢？唉，女人难懂，难懂女人分子生物学技术在临床检验诊断中的应用日期:2010-06-04 13:52:56 来源:中华检验医学网 点击:1446 次    现代分子生物学是研究生物大分子-核

28、酸及其表达产物蛋白质的结构、功能、遗传、调控、相互关系和相互作用，从分子水平上探讨生命现象的科学，其主要研究对象是核酸（DNA和RNA）和蛋白质。自从1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构以来，分子生物学在短短五十年时间里以超乎想象的速度飞速发展，渗透到医学每一个领域。可以毫不夸张的说，如果没有分子生物学的应用，人类探索生命活动的行为将会寸步难行。    将分子生物学技术应用到临床检验诊断学，使疾病诊断深入到基因水平，称为基因诊断。基因诊断技术主要包括核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）技术、基因多态性分析技术、单链构象多态性（SSCP）分

29、析技术、荧光原位杂交染色体分析（FISH）技术、波谱核型分析（SKY）技术、DNA测序技术、基因芯片技术以及蛋白质组技术等，一些先进的分离和检测技术大大促进了上述技术的完善和发展，如毛细管电泳技术（CE）、液质联用技术（LC/MS/MS）、变性高效液相色谱技术（DHPLC）、非荧光遗传标记分析技术等。基因诊断在感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤性疾病等的诊断中发挥越来越重要的作用。下面，我们就临床检验诊断中涉及的主要分子生物学技术作一简要介绍。  1核酸分子杂交技术即基因探针技术。利用核酸的变性、复性和碱基互补配对的原理，用已知的探针序列检测样本中是否含有与之配对的核苷酸序列的技术。是临床

30、应用最早的，也是最基础的分子生物学技术，是印迹杂交、基因芯片等技术的基础。不少探针已经商品化。  2PCR技术    PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促反应，可以短时间扩增出两段已知序列之间的DNA，用于诊断、鉴定、制备探针及基因工程产品开发等，是一项及其有效和实用的技术。由于PCR试验存在一定的假阳性和假阴性问题，导致PCR技术在我国临床诊断中的应用曾一度被叫停，近年来由于改进的PCR技术如巢式PCR（nested PCR）、多重PCR(multiplex PCR) 、荧光PCR技术等在较大程度上增加了该技术的敏感性和特异性，加上卫生部于 200

31、2-01颁发了有关基因扩增检验技术临床应用的法规性文件临床基因扩增检验试验室管理暂行办法(卫医发200210号 )，要求从事临床基因扩增检验的技术人员必须经过卫生部临床检验中心或授权的省级培训机构的上岗培训，持证上岗，使PCR技术在临床检验诊断中重新发挥其不可替代的作用，PCR已广泛用于核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测，尤其在感染性疾病诊断方面更有应用价值。  3基因多态性分析技术    在人群中，各个体基因的核苷酸序列会存在一定差异，称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于人的基因组中，并按孟德尔遗传方式遗传。如果在某个家庭中，某一致病基因与

32、特定的多态性片段紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种“遗传标记”来判断家庭成员或胎儿是否携带有致病基因。目前认为基因多态性是个体的“身份证”；有的虽然不表现疾病，但也许会影响对药物的反应和用药效果。因此，基因多态性分析技术已经广泛应用于群体遗传学研究、疾病连锁分析和关联分析、疾病遗传机制研究、肿瘤易感性研究、个性化用药等诸多方面。遗传学上把基因多态性片段称为遗传标记。遗传标记分析经历第一代限制性酶切片段多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、第二代微卫星DNA(Microsatellite DNA)，现已发展到第三代单核苷酸多

33、态性分析(single nucleotide polymorphism, SNP)。下面分别介绍如下：  3.1限制性酶切片段多态性(RFLP)分析技术    RFLP是利用限制性内切酶在特定的核苷酸序列切割双链DNA后凝胶电泳分离开不同大小片段，由于不同个体存在核苷酸序列差异导致限制性酶切位点变化从而使酶切片段呈现多态现象。传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切，电泳分离后再结合Southern 印迹杂交，构建出DNA指纹图，这种方法特异性和敏感性均较高，但操作繁杂。目前结合PCR技术产生PCR-RFLP方法，是检测与特定的酶切位点有关的

34、突变的简便方法。RFLP方法在遗传性疾病诊断、微生物种属分型、肿瘤发病及诊断研究等领域应用广泛。  3.2 微卫星DNA分析技术    微卫星DNA(Microsatellite DNA)，又称为短小串联重复(Short tandem repeats, STR)或简单重复序列 (Simple repeat sequence, SRS或SSR) ，广泛存在于原核生物和真核生物基因组中，常见的有二、三、四核苷酸重复序列，约占真核生物基因组的 5%，其基本构成单元 (核心序列 )为 1 6bp。其中最为常见的是双核苷酸重复即 (CA)n和 (TG)n，人类基因

35、组约有5×1041×105个 (CA)重复序列，占 10 %。每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目约为 1060次，其长度一般不超过 300bp，多位于基因非编码区、内含子或非翻译区，可存在于lu序列中或卫星序列中，但在编码序列及外显子中也可找到。微卫星DNA的高度多态性主要来源于串联数目的不同。关于微卫星DNA多态性产生的机制，目前普遍认为是DNA复制过程中滑动或DNA复制和修复时链滑动与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的缺失或插入。    微卫星DNA是近年来飞速发展起来的一种新型的DNA高度多态性遗传标记系统，具有种类多

36、分布广泛、高度多态性、杂合性高、重组率低的特点，在群体中变异范围大，构成了丰富的长度多态性，有高度的个体特异性，并遵循孟德尔共显性遗传规律，提供了众多有高度遗传信息的新的多态性标记。这种多态性标记已广泛用于构建人类遗传图谱、法医学亲子鉴定、遗传疾病和肿瘤发生机制的研究、疾病相关基因、疾病连锁基因和易感基因的研究、以及疾病诊断等等。  3.3单核苷酸多态性分析(SNP)技术    随着基因组测序工作的进展，日益发现基因组中存在着数量庞大的 SNP。SNP是一种最常见的可遗传变异，在人类DNA多态性中，SNP约占 90 %。 SNP是指在基因组内特定核苷酸位

37、置上存在两种不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1 %。 SNP分为两种形式，一是基因编码区的 SNP，称为 cSNP；二是遍布于基因组的大量单碱基变异。SNP作为一种碱基的替换，大多数为转换，即一种嘌呤换为另一种嘌呤或一种嘧啶换为另一种嘧啶，转换与颠换之比为 21。研究发现，SNP在人类基因组 CpG序列上出现最频繁，约占全部SNP的25%，而且多为 CT，原因在于CpG中胞嘧啶残基 (C)是甲基化的，能够自发地脱氨基产生胸腺嘧啶 (T)。因此，SNP与 RFL P和 STR等 DNA标记的主要不同在于：它不再以“长度”的差异作为检测手段，而是直接以序列的差异作为标记。但 SNP单个

38、基因座的多态性很差，只有二态，为此采用多个SNP基因座进行“单倍型” 分析尤显重要。与第 1、2代遗传标记相比，SNP分析具有以下特点：(1 )SNP数量大，分布密集，平均每 1000bp就有1个 SNP。在 PKD基因内部或附近可能会找到许多 SNP，联合用于ADPKD的单倍型诊断；(2 ) SNP比STR扩增更可靠，不会产生假带；(3 )由于 SNP是二态的，易于自动化批量检测，易于计算机分析结果。    SNP的研究已受到广泛的重视，它已成为实验室和公司争夺的对象，也是人类基因组计划中的一个重要补充和研究热点。用于 RFLP、STR的技术方法，理论上均可用于

39、 SNP的识别和检出。但印迹分析和 PCR方法，如 SSCP、DGGE等，大都需要标记和电泳，费时费力，难于自动化。近年来，采用了微阵列 DNA芯片、飞行质谱分析和变性高效液相层析法等非电泳分型技术，大大加快了SNP检测效率。    SNP检测已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。尽管没有人怀疑SNP在搜寻疾病基因方面的价值，但事实却比人们想象的要难得多。首先基因中存在着的重组破坏了SNP和增加疾病风险性的变异之间的联系，使得相关分析变得困难。有研究指出关联分析比典型的家系分析需要的样本要多得多，

40、以便筛除错误的信号。因此只有高速率分析数千个DNA样本的新技术的出现才会使SNP分析变得真正有价值；其次，虽然关联分析对于只有一个基因位点上的缺陷等位基因的鉴定有实用意义，但这种情况又不常见，大约 90 %疾病易感基因有 1 0个以上相关突变存在，而癌症及其它一些疾病则常涉及多个基因。另外，最普遍的SNP也是最古老的，他们可以同时存在于正常人或患者中，这就意味着SNP和基因的关键突变之间的特定联系可能不存在一个特殊的模式，人们很容易错失一个很重要的联系，或者作出一个错误的联系。样本数量也是SNP应用的一个障碍。尽管大部分SNP出现在各种群体中，但是某一种SNP可能只出现在一个亚群中，一些有意义

41、的cSNP也以相当高的比例出现在某一亚群中。所以要搜寻SNP就要尽可能地采用多种多样的大样本。专利问题也限制着SNP技术应用。由于SNP具有的新颖性、实用性和不明确性等特征，使得许多商业公司抢先获得SNP后能够对其申请专利，限制了许多研究者对它们的使用。  4单链构象多态性分析(SSCP)技术    SSCP是一种简便快速的检测DNA或cDNA突变的技术。其技术原理和过程是：将PCR扩增到的待测DNA或cDNA片段变性，成为单链DNA，在一定条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将单链DNA变性。由于单链DNA的空间构象与分子内碱基组成密切相关，一个碱基的差异即

42、可形成不同的构象，不同构象的DNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的泳动速率不同，形成的带型则不同，故能反映出单链DNA片段的多态性。  5DNA测序技术    将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链寡核苷酸，并使其一端为一固定的末端。另一端由于长度不同，成为一系列相差一个碱基的连续末端。在分别含有4种脱氧核酸的反应体系中，寡核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。将4种反应体系的寡核苷酸产物，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离。由于全部可能产生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4种反应产物中，从放射自显影后的4种末端寡聚核苷酸梯子

43、形图谱中，就可以直接读出DNA序列。DNA测序技术使直接检测核苷酸突变成为可能，而不仅仅是基因片段的多态性分析，使临床基因诊断更加精确。常用于探针设计、特异引物合成、基因结构分析等，在遗传病诊断、微生物种属鉴定、肿瘤诊断等领域广泛应用，人类基因组计划就是由于大规模自动化测序技术的发展而顺利完成的。但由于DNA测序方法复杂，一般临床实验室无法进行，有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行。   6DNA芯片技术    DNA芯片技术，实际上就是一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直

44、接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。根据芯片的制备方式可以将其分为两大类：原位合成芯片和DNA微集阵列(DNA microarray)。芯片上固定的探针除了DNA，也可以是cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列。因此，DNA芯片又被称为基因芯片、 cDNA芯片、寡核苷酸阵列等。    作为新一代基因诊断技术，DNA芯片的突出特点在于快速、高效、敏

45、感、经济，平行化、自动化等，与传统基因诊断技术相比，DNA芯片技术具有明显的优势：基因诊断的速度显著加快，一般可于30 min内完成。若采用控制电场的方式，杂交时间可缩至1 min甚至数秒钟。检测效率高，每次可同时检测成百上千个基因序列，使检测过程平行化。基因诊断的成本降低。芯片的自动化程度显著提高，通过显微加工技术，将核酸样品的分离、扩增、标记及杂交检测等过程显微安排在同一块芯片内部，构建成缩微芯片实验室。因为是全封闭，避免了交叉感染；且通过控制分子杂交的严谨度，使基因诊断的假阳性率、假阴性率显著降低。    DNA芯片技术在肿瘤基因表达谱差异研究、基因突变、基

46、因测序、基因多态性分析、微生物筛选鉴定、遗传病产前诊断等方面应用广泛。如感染性疾病是由于病原微生物(病毒、细菌、寄生虫等)侵入机体而引起。目前已经获得一些生物的全部基因序列，包括141种病毒，几种细菌(流感嗜血杆菌、产甲烷球菌、支原体M.genitalium及实验室常用的大肠杆菌等)和一种真核生物(酿酒酵母)，且数量还在增长。因此，将一种或几种病原微生物的全部或部分特异的保守序列集成在一块芯片上，可快速、简便地检测出病原体，从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。用DNA芯片技术可以快速、简便地搜寻和分析DNA多态性，极大地推动法医生物学的发展。比如将个体SNPs设计在一块DNA芯片上，与样品DNA杂交

47、，即可鉴定基因的差异。人的体型、长相约与500多个基因相关，应用DNA芯片原则上可以揭示人的外貌特征、脸型、长相等，这比一般意义的DNA指纹谱又进了一步。 应用DNA芯片还可以在胚胎早期对胎儿进行遗传病相关基因的监测及产前诊断，为人口优生提供有力保证；而且可以全面监测200多个与环境影响相关的基因，这对生态、环境控制及人口健康有着重要意义。  7蛋白质组及分析技术    随着大量生物体全基因组序列的获得，特别是人类基因组序列草图的完成，基因组学研究重点不可避免地从结构基因组学转向功能基因组学，而蛋白质组学（proteom）正是作为功能基因组研究的重要支柱

48、在上世纪90年代中期应运而生。蛋白质组是指一个基因，一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。蛋白质组学可以分为三个领域：蛋白质的大规模的分离与鉴定，以及它们的表达后修饰；蛋白水平的差异显示在疾病中的运用；运用当前的一切手段研究蛋白质与蛋白质之间的相互关系。与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性。对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同，即使同一细胞在不同的时期，不同条件下，其蛋白质表达也不同。虽然可以通过cDNA芯片等方法显示生物体的基因启动状况，但mRN

49、A水平 (包括mRNA的种类和含量 )并不能完全反映出蛋白质的表达。另外从研究手段方面来说，蛋白质研究技术比基因技术相对要复杂和困难，不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基，而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段，这样对于丰度低但功能重要的蛋白质很难进行大规模的研究。    目前，蛋白质组学研究的主要技术包括：双向（二维）聚丙烯酰胺凝胶电泳（结合等电聚焦和IEJK）分离蛋白质，在固相载体上形成蛋白质-多肽图谱，用敏感的方法染色（如银染）并用图像分析电子计算机进行鉴定；将蛋白质点切下，用酶消化，进一步用氨基酸分析、质谱分析等进行鉴定；或结合蛋白质的

50、毛细管电泳，高效液相色谱技术（HPLC）以至蛋白质芯片进行鉴定。    蛋白质芯片 (protein array)是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间如 (抗体与抗原 )在空间构象上能特异性的相互识别。此方法与传统的研究方法相比具有如下优点：蛋白质芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供相当大的信息量，使我们能够全面、准确的研究蛋白表达谱，这是传统的蛋白研究方法无法做到的。蛋白质组芯片的灵敏度高，它可以

51、检测出蛋白样品中微量蛋白的存在，检测水平已达ng级。美国科学家Haab等运用绿色荧光 (green fluorescence)标记抗体微阵列，用红色荧光 (red fluorecence)标记蛋白混和物，并运用计算机识别 (R/G)的信号强弱，来进行检测，检测水平可达到 1ng/ml。蛋白质芯片具有高度的准确性。    蛋白质组芯片可用于蛋白质组学研究中的各个领域，具体来说大致可分为三个方面：研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，筛选新的蛋白质；蛋白质芯片能够用于现在其它方法不能检测到的，如蛋白质-药物、蛋白质-脂质之间的相互作用；蛋白质组芯片还可用于检测蛋白与小分子

52、物质的作用。例如蛋白质与DNA ，RNA分子等。蛋白质芯片的制作是决定其运用的关键因素之一，蛋白质组芯片的制作比当前流行DNA芯片制作要复杂，特别是涉及大量不同种类的蛋白的高效表达与纯化。因此，蛋白质芯片制作存在费时、费力且成本较高等不足，限制了其在临床的应用。    8荧光原位杂交染色体分析技术（FISH）    FISH是上世纪80年代中期发展起来并直到现在仍在不断改进、完善的技术。其基本过程是：首先制成染色体标本，和与所感兴趣的目的基因（或染色体片段）互补的探针，并在探针上标记荧光色素，当探针与染色体标本上的靶序列杂交后，利用荧光显微镜观

53、察荧光信号从而获得染色体核型的信息。此技术具有灵敏度强、背景低、快速等优点，避免了使用稳定性差、暴光时间长、易污染环境的放射性核素，成为细胞遗传学与分子生物学之间沟通的桥梁。这项实用技术不仅可用于基因在染色体上的定位研究，而且可直接用于实验室诊断。例如，应用bcr-abl基因探针进行FISH染色体分析诊断慢性髓系白血病。近年来FISH技术不断发展，产生了染色体原位抑制（CISS）技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA合成（PRINS）技术等，并且发展出多色FISH和多重FISH技术广泛应用于染色体数目和结构畸变及断裂点检测，标志染色体的识别，多个不同基因的染色体定位，物理图谱的制作，基因缺

54、失和扩增的检测等，在肿瘤细胞遗传学分析中发挥了重要作用。  9波谱核型分析技术（Spectral karyotyping, SKY）    传统FISH技术采用的荧光显微术基于荧光色素特异性的光学滤镜进行单强度的荧光检测，因此很难同时获得多个信号用于分析。1996年，Schrock等将傅立叶光谱学、CCD成像技术和光学显微术结合起来，建立了SKY技术，可以在可见光和近红外区的所有位置同时检测样品的发射光谱，从而可利用发射光谱内所有信息进行分析。目前SKY技术可以补充染色体常规显带分析的不足，清楚地说明G显带不能解释的复杂染色体畸变，主要用于肿瘤细胞的遗传

55、学分析，检测复杂的细胞遗传学异常，也可用于比较细胞遗传学的种间进化差异性研究等方面。  10分子生物学相关技术的发展及作用  10.1 毛细管电泳技术（capillary electrophoresis, CE）    CE是一项迅速发展的分离技术，主要用于生物大分子的分离，如DNA和被十二烷基磺酸钠 (SDS)饱和的蛋白质，是在一根内径25100m毛细管内进行的，毛细管中充入交联聚合物，聚合物起到了分子筛的作用，使质量电荷比相同的物质能够按照分子由小到大的顺序流出，从而实现了分离。分辨率高于高效液相色谱，进样量只需 150nl，在毛细管上开一

56、检测窗口，直接进行柱上检测，灵敏度较高，而且样品前处理非常简便，适用于大量临床样品的分析。CE有多种分离模式，其中毛细管凝胶电泳已越来越广泛地用于基因诊断、基因治疗等临床分子生物学领域。    毛细管凝胶电泳与传统的板式或管式凝胶电泳相比，具有以下特点：(1 )分辨率高，因为毛细管电泳可以施加比板式电泳高 10100倍的场强，毛细管本身已经具有抗对流作用，不必再使用具有抗对流性的凝胶：(2 )分析速度快；(3 )定量更加准确，避免了电泳染色时因时间、温度、染色剂浓度和放置时间不同而产生的误差；(4)灵敏度更高，毛细管电泳为柱上检测，如使用激光诱导荧光检测器，检测限

57、可以提高到10-18到10 21mol/L；(5)实现自动化操作。能够进行制备性分离是板式凝胶电泳的优点，目前毛细管电泳使用大孔径毛细管和低场强，只可以进行少量制备，这项技术更适合于临床实验室高灵敏度快速分析的要求。    应用CE对PCR产物进行分析可以克服常规琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法分析速度慢、操作繁琐、定量结果误差大、自动化程度低的缺点，现已广泛应用于病原体、肿瘤和遗传病的基因诊断，如病原体特异基因检测、基因突变检测、DNA序列分析等。   10.2 液质联用技术（LC/MS/MS）    在分析

58、仪器行业中，质谱仪（mass spectrometer, MS）是灵敏度最高，对未知化合物的结构分析及定性最准确，要求相应标准样品或对测定化合物的了解最少的定性手段。而高效液相色谱（HPLC）则是分离化合物范围最广、准确度高、对化合物破坏性小的快速分离方法，特别适用于生物提取物的分离。随着电喷雾界面核大气压化学电离界面这两个技术成熟后，HPLC和MS/MS技术才实现成功联用，LC/MS/MS才实现飞速发展，成为科研和临床分析的有力工具。    将LC/MS/MS应用于基因遗传性代谢紊乱疾病的诊断，可在2分钟内通过检测血液中氨基酸或酰基肉碱水平异常可快速筛选出近30

59、种基因遗传性代谢紊乱疾病，如各种氨基酸代谢失常血症包括胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症；短链核长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其他各种有机酸代谢失常疾病等。另外，LC/MS/MS在多肽、激素、寡核苷酸以及药物成分分析等方面应用广泛。  10.3 变性高效液相色谱技术（DHPLC）    变性高效液相色谱 (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)是一项在单链构象多态性

60、(SSCP)和变性梯度凝胶电泳 (DGGE)基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。DHPLC检测变异的基本原理：将工作温度 (柱温 )升高使DNA片段开始变性，部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链 (错配的 ) DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。这一技术最先由Oefner于 1 995年建立，目前全球使用最多也最易操作的是美国transgenomic公司开发的WAVE

61、60; 核苷酸片段分析系统，它通过一个独特的DNA色谱柱DNA Sep柱进行核酸片段的分离和分析。    方法学比较研究表明，DHPLC敏感性和特异性可达 96%100 %，明显高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等变异检测技术。目前只有基于毛细管电泳技术发展起来的荧光单链构像多态性分析(F-SSCP)在敏感性和特异性方面能与DHPLC相媲美。但PCR引物的设计、PCR方法及条件、分离温度及分离梯度等关键因素也影响DHPLC检测敏感性。目前，该技术在基因突变检测、DNA微卫星鉴定、肿瘤杂合性缺失的检测、RT-PCR的竞争性定量、基因作图、细菌鉴定、DNA

62、片段大小测定及寡核苷酸的分析和纯化等许多基因组研究领域中应用广泛，最近已被进一步应用到mRNA的检测，鉴定差异表达的基因。  10.3 非荧光标记的遗传标记分析技术    近年来，美国GENTEON公司采用激光致导的动态荧光检测技术（Dynamic fluorescence），结合多通道毛细管电泳技术，研制出Capella 400型全自动基因分析系统。该仪器采用动态荧光检测技术，彻底消除了传统荧光DNA标记检测的高成本和复杂性，可精确有效到检测未经标记的单链或双链核苷酸。Capella 400系统是全球迄今为止首创的第一台全自动384道毛细管电泳仪，该系统采用专利化学品与一个具有精密光学结构的旋转圆柱状毛细管阵列相组合，同一系统可进行多种核酸的高通量分析，可应用于SNP、STR、RFLP/AFLP分析，寡聚核苷酸片段质量控制分析、PCR产物质量控制分析、基因表达分析、DNA测序等。  11. 分子生物学技术在临床检验诊断应用中的问题与展