正交法筛选组穴对脑缺血再灌注损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶信号转导通路的影响

1、www.CRTER.org冯毅慧，等. 正交法筛选组穴对脑缺血再灌注损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶信号转导通路的影响正交法筛选组穴对脑缺血再灌注损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶信号转导通路的影响冯毅慧1，朱志华1，吴春晓2，周国平2(1广西中医药大学附属瑞康医院针灸科，广西壮族自治区南宁市 530011；2南方医科大学，广东省广州市 510515)引用本文：冯毅慧，朱志华，吴春晓，周国平. 正交法筛选组穴对脑缺血再灌注损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶信号转导通路的影响J.中国组织工程研究，2016，20(40):5953-5958.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.201

2、6.40.004 ORCID: 0000-0002-5496-3342(冯毅慧)文章快速阅读：对合谷、足三里、尺泽和三阴交进行电针刺激能有效治疗脑缺血再灌注损伤冯毅慧，女，1982年生，湖南中医药大学博士，主治医师，主要从事针刺作用机制研究。通讯作者：周国平，主任医师，南方医科大学，广东省广州市 510515中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)40-05953-06稿件接受：2016-08-25经正交法筛选的合谷、足三里、尺泽、三阴交能有效减少脑缺血再灌注大鼠的梗死面积，且该效应可能与其调节受损脑组织中ERK信号通路密切相关对百会、曲池、足三里、尺泽、三阴

3、交、合谷进行正交筛选正交1，2，3号组采用正交法筛选的穴位组合进行电针刺激。正交1号组为百会、曲池、足三里、尺泽，正交2号组为百会、足三里、尺泽、三阴交，正交3号组为合谷、足三里、尺泽、三阴交大脑中动脉闭塞建立脑缺血再灌注模型文题释义：缺血再灌注损伤：脑组织缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因。缺血再灌注损伤时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变越明显：线粒体肿胀，有钙盐沉积，并可见线粒体嵴断裂、核染色质凝集、内质网高度肿胀，结构明显破坏、星形细胞肿胀，Nissl体完整性破坏、胶质细胞、血管内皮细胞肿胀，周围间隙增大并有淡红色水肿液、白质纤维间隙疏松，血管内由微血栓、髓鞘分层变

4、性，呈现不可逆损伤。信号转导通路：在细胞中，各种信号转导分子相互识别、相互作用，将信号进行转换和传递，构成信号转导通路。当外界环境变化时，单细胞生物可以直接做出反应，多细胞生物则通过复杂的信号传递系统来传递信息，从而调控机体活动。传导方式包括相邻细胞直接接触、细胞分泌各种化学物质来调节其他细胞代谢和功能。在脑缺血再灌注损伤中，信号通路是近年来研究的热点之一，丝裂原活化蛋白激酶级联反应是近年发现的细胞质和细胞核联系的枢纽，其在接受不同通路的上游信号后，激发即早基因和转录因子的表达和活化，并通过相应的靶基因、靶蛋白等的表达与合成来完成对各种胞外刺激的反应，在细胞凋亡的信号传导方面起着关键性的作用。

5、摘要背景：既往电针治疗脑缺血再灌注损伤观察的针刺穴位搭配较少。目的：探讨电针正交实验所选组穴对脑缺血再灌注损伤后细胞外信号调节激酶信号通路的影响。方法：150只SD大鼠随机等分为5组，假手术组只暴露大脑中动脉；模型组及正交1，2，3号组建立脑缺血再灌注模型。正交1，2，3号组采用正交法筛选的穴位组合进行电针刺激。正交1号组为百会、曲池、足三里、尺泽，正交2号组为百会、足三里、尺泽、三阴交，正交3号组为合谷、足三里、尺泽、三阴交。 结果与结论：与模型组相比，正交1，2，3号组大鼠神经功能缺损评分降低，脑梗死面积缩小，脑缺血区微血管密度数量及缺血侧皮质和海马CA1区中磷酸化细胞外信号调节激酶表达水

6、平增加，且正交3号组变化最为显著。提示电针经正交法筛选的合谷、足三里、尺泽、三阴交能有效减少脑缺血再灌注大鼠的梗死面积，且该效应可能与其调节受损脑组织中细胞外信号调节激酶信号通路密切相关。关键词：实验动物；神经损伤与修复动物模型；电针；脑缺血再灌注；正交实验； 细胞外信号调节激酶信号通路；微血管密度；细胞凋亡；国家自然科学基金主题词：电针；脑缺血；组织工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083基金资助：国家自然科学基金项目(81173355)缩略语：磷酸化细胞外信号调节激酶：phospho- ertracellular-singnal regulat

7、ed kinase，p-ERKEffects of electroacupuncture at points selected by orthogonal experiment on the extracellular signal regulated kinase signal pathway in a rat model of cerebral ischenia-reperfusion injuryFeng Yi-hui1, Zhu Zhi-hua1, Wu Chun-xiao2, Zhou Guo-ping2 (1Department of Acupuncture, Ruikang Ho

8、spital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: Acupuncture point matching is little reported in the electroacupuncture for cerebral isc

9、hemia-reperfusion injury.OBJECTIVE: To explore the influence of electroacupuncture acupoints selected by orthogonal experiment on rats with cerebral ischemia reperfusion and extracellular signal regulated kinase (ERK) signal pathway. METHODS: 150 Sprague-Dawley rats were randomly divided into five g

10、roups: sham operation group rats were exposed the middle cerebral artery only; models of cerebral ischemia reperfusion were established in the rats in model and orthogonal groups. Then rats in the orthogonal groups 1 (Baihui (DU 20), Quchi (LI 11), Zusanli (ST 36), and Chize (LU 5), 2 (Baihui (DU 20

11、), Zusanli (ST 36), Chize (LU 5), and Sanyinjiao (SP 6) and 3 (Hegu (LI 4), Zusanli (ST 36), Chize (LU 5) and Sanyinjiao (SP 6) were given electroacupuncture at acupoints selected by orthogonal experiment, respectively.RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, in all orthogonal groups,

12、the neurological function deficit scores were decreased, infarct volume was smaller, the number of microvessel density in the ischemia region and the p-ERK expression level in the cortex and hippocampal CA1 region of ischemic hemisphere were increased, and significant changes were found in the ortho

13、gonal group 3. These findings indicate that electroacupuncture at points of Hegu (LI 4), Zusanli (ST 36), Chize (LU 5) and Sanyinjiao (SP 6) selected by orthogonal experiment can significantly reduce the infarct volume of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats possibly by regulating the ERK si

14、gnaling pathway. Subject headings: Electroacupuncture; Brain Ischemia; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81173355Cite this article: Feng YH, Zhu ZH, Wu CX, Zhou GP. Effects of electroacupuncture at points selected by orthogonal experiment on the extrace

15、llular signal regulated kinase signal pathway in a rat model of cerebral ischenia-reperfusion injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(40):5953-5958.Feng Yi-hui, M.D., Attending physician, Department of Acupuncture, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanni

16、ng 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Zhou Guo-ping, Chief physician, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China5955ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction脑血管疾病是神经系统常见病和多发病，缺血性脑血管病占全部脑血管病的55%-80%，且具有死亡率高、致残率高的特点1，严重威胁

17、着人类的健康。目前尚缺乏治疗缺血性脑血管病的特效药物和方法，而具有整体良性调节作用的针灸疗法对脑血管疾病的治疗效果较好，其机制的研究也日益深入并趋于多元化2。为进一步提高针刺的疗效，了解治疗机制，作者拟采用正交实验设计方法，对近年来针刺治疗脑缺血再灌注损伤较为有效的穴位进行筛选配对，观察其治疗效果及其对脑部血流的影响。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2014年7月至2015年3月在广西医科大学动物实验中心完成。1.3 材料实验动物：选取清洁级成年健康雄性SD大鼠150只，鼠龄9周，体质量260-300 g，由

18、南方医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2011-0015，饲喂以标准育成饲料，自由饮水。动物于实验前适应环境一周，控制室温20-22 ，相对湿度65%-70%。实验前大鼠在安静环境下饲养24 h以上，术前禁食12 h，不禁水。主要试剂及仪器：蛋白酶K工作液购自上海翊圣生物科技有限公司；DAPI由北京索莱宝科技有限公司提供；EDTA抗原修复缓冲液购自上海鲁汶生物科技有限公司；牛血清白蛋白由南京安培化工科技有限公司提供；TTC，二甲基亚砜购自Sigma公司；免疫组化试剂盒，DAB显色试剂的生产厂家是北京中杉金桥生物技术有限公司；TUNEL检测试剂盒由凯基生物有限公司提供；毫针(直径0

19、.3×25 mm)购自苏州天协针灸器械有限公司；CJ-2F型医用净化工作台购自苏州苏洁净化设备有限公司；AEU-210电子天平由厦门欣锐仪器仪表有限公司提供；-20 低温冰箱由北京福意电器有限公司提供；电热恒温干燥箱购自上海丙林电子科技有限公司；DSC-RX100M2数码相机购自索尼(中国)有限公司；Bx-70显微成像系统购自上海普赫光电科技有限公司；Leica Qwin图像信号采集与分析系统、Image-ProPlus图像分析处理系统购自徕卡仪器有限公司；XS-200型双目显微镜由上海彼爱姆(BM)光学仪器制造有限公司提供；英迪KWD-808I全能脉冲电子针灸电疗仪的生产厂家是常州

20、英迪电子医疗器械有限公司。1.4 方法1.4.1 正交配穴设计 按照张海湃等3归纳总结近5年治疗缺血再灌注损伤针刺治疗的有效穴位：百会、水沟、大椎、足三里、曲池、少海、尺泽、合谷、三阴交9个穴位，将每一个穴位作为一个因素，每个因素设/10和/00两个水平(/10为有此穴位，/00为无此穴位)，选择L12(211)正交表，共得12个配方。根据醒脑开窍、活血通络治则，选取百会、曲池、足三里、尺泽配对；百会、足三里、尺泽、三阴交配对；三阴交、足三里、尺泽、合谷配对。1.4.2 动物分组 150只SD大鼠随机等分为5组：假手术组、模型组及正交1，2，3号组。1.4.3 模型制备 假手术组只做手术暴露大

21、脑中动脉，不予线栓，缝合伤口。其他各组采用改良Longa等4方法，制作大鼠脑缺血再灌注模型。术后待大鼠生命体征稳定后，按照Longa五级4分法进行评分：0分：无神经功能缺失症状；1分：轻度局灶神经功能缺失(不能完全伸展左侧前肢)；2分：中度局灶神经功能缺失(向左侧转圈)；3分：重度神经功能缺失(向左侧倾斜)；4分：不能自发行走，意识水平降低。评分为1-3分大鼠，造模成功纳入实验。成模后大鼠在室温20 环境下单笼饲养，自由进食、水，必要时滴管喂水。大鼠解剖后，取全脑可见脑梗死灶位于颞叶皮质区，与大脑中动脉支配的脑供血区域一致，说明实验的模型制作成功。取脑时发现有明显蛛网膜下腔出血者，剔除出实验。

22、1.4.4 穴位定位 选取大鼠百会、及左侧曲池、合谷、尺泽、三阴交、足三里为电针穴位5；利用华佗牌不锈钢银针(直径为0.38 mm，长度为1寸)取“百会”穴斜刺入头皮1寸，直刺“合谷”、“尺泽”、“三阴交”、“足三里”穴2 mm，通电刺激，每组通电方式均要形成环路，电针治疗仪采用频率为2/20 Hz，波型为疏密波，刺激时间为30 min，强度以大鼠肢体轻度颤动为度6，正交1，2，3号组大鼠按同一时间点每天电针1次，直至取材。1.4.5 取材 于再灌注后2 h，6 h，1 d，3 d及1周时将大鼠经水合氯醛麻醉后开胸，先后用生理盐水、预冷的 40 g/L多聚甲醛固定液灌流取出全脑，石蜡包埋，切片

23、。 1.4.6 微血管密度计数 采用SP法染色，使用血管内皮细胞标志物鼠抗人CD34单克隆抗体进行检测，阴性对照为PBS。参照Weidner7的方法并稍加改进：在100倍镜下寻找微血管高密度区，在400高倍镜下计数5个视野中微血管数量，取平均值。每个被染成棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇(不论有无管腔)，只要独立于周围血管或其他结缔组织的就可被判定为1个微血管；呈管状者只要结构不连续，其分支结构也作为1个微血管计算分辨不清或染色模糊的细胞不计数；肌性厚壁血管不计数；管腔大于50 m或直径大于8个红细胞大小的血管也不计数8。1.4.7 脑梗死体积的测定 将储存于-80 冰箱新鲜脑组织置于-20 冰箱

24、保存20 min后，再用pH 7.2的PBS配置2% TTC溶液50 mL，在37 水浴锅中避光预热；用刀片自距大脑额部2 mm处沿冠状面将脑组织切成2 mm厚薄片，每个脑组织切成5片薄片；在暗室中将脑组织切片置2%TTC中，放入37 水浴锅中30 min，每5 min翻动脑片，使脑组织均匀完全接触到染色液；染色完成后，梗死部分被染成白色，未梗死区域被染成红色，40 g/L多聚甲酸磷酸盐缓冲液(pH 7.2)固定过夜；将染色后的脑组织切片整齐的置于带有刻度的标尺上，用高分辨率数码相机拍照输入计算机，应用Image- ProPlus图像分析处理系统计算每片脑组织脑梗死体积(梗死体积=每个脑片梗死

25、面积×2 mm)，每个脑组织梗死的总体积由连续切割的5片脑组织的梗死体积相加所得。1.4.8 磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho- ertracellular-singnal regulated kinase，p-ERK)表达水平的检测 采用免疫组化检测p-ERK表达水平，将石蜡切片脱蜡至水：二甲苯孵育，梯度乙醇复水，蒸馏水洗。EDTA抗原修复缓冲液(pH 9.0)微波炉抗原修复。PBS(pH 7.4)洗，在体积分数3%过氧化氢溶液室温避光孵育20 min，PBS(pH 7.4)洗。一抗(1200)湿盒内4 孵育过夜。PBS(pH 7.4)洗。滴加HRP标记的二抗室温孵育50

26、min。PBS(pH 7.4)洗。DAB显色，自来水冲洗终止反应。Harris苏木精复染3 min左右，自来水洗，体积分数1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。将切片依次放入梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。分别在大脑缺血侧皮质及海马B300250200150100500模型组正交1号组正交2号组正交3号组假手术组 A假手术组 模型组 正交1号组 正交2号组 正交3号组aceacdp-ERK表达水平(灰度值)大脑皮质区 海马CA1区acabacacdabacabaaaaaaaababaa2 h 6 h 1 d 3 d 1周 再灌注后时间图2 电针对缺血再灌注大鼠大脑缺血

27、侧皮质及海马CA1区中p-ERK表达水平的影响Figure 2 Effects of electroacupuncture on the p-ERK expression level in the cortex and hippocampal CA1 region of ischemic hemisphere in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury图注：图中A为再灌注后1周时大鼠大脑皮质及海马CA1区中p-ERK表达水平(免疫组化染色，×400)，p-ERK阳性表达成棕黄色；B为电针对缺血再灌注大鼠大脑缺血侧皮质及海马CA

28、1区中p-ERK表达水平的影响，与假手术组相比，aP < 0.01；与模型组相比，bP < 0.05，cP < 0.01；与正交1，2号组相比，dP < 0.05，eP < 0.01。正交3号组正交2号组正交1号组模型组aaaabcaabc神经功能缺损评分3.53.02.52.01.51.00.50aa2 h 6 h 1 d 3 d 1周 再灌注后时间图1 电针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能缺损评分的影响Figure 1 Effects of electroacupuncture on the neurological function defect scor

29、es of rat models of cerebral ischemia-reperfusion injury图注：与模型组相比，aP < 0.05，bP < 0.01；与正交1，2号组相比，cP < 0.05。CA1区随机取5个视野，计算平均灰度值。1.5 主要观察指标 大鼠神经功能评分；脑梗死面积；p-ERK表达水平；微血管密度。1.6 统计学分析 数据均用±s表示，应用SPSS 16.0版统计软件处理，统计分析采用单因素方差分析，多组间进一步比较采用LSD检验，相关分析采用Spearman相关分析，检验水准a=0.05，P < 0.05为差异有显著性意

30、义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 150只大鼠造模后均进入结果分析，无脱失。2.2 神经功能缺损评分 造模后，大鼠出现不同程度活动障碍，神经功能缺损表现。正交1，2，3号组大鼠神经功能缺损评分较模型组低，正交3号组大鼠较其他组神经功能在再灌注3 d后稍有改善，模型组及正交1，2，3号组大鼠再灌注3 d后神经功能明显改善(表1，图1)。2.3 脑梗死面积 造模后，大鼠脑组织出现不同程度的梗死区域，在治疗后6 h内变化不大，1 d以后，正交1，2，3号组大鼠脑梗死面积开始减少，3 d后开始明显减少，以正交3号组大鼠脑缺血区的改善较为明显(表2)。2.4 缺血区半暗带微血管密度

31、数量 造模后，大鼠脑组织缺血区半暗带微血管数量在2 h内基本没有影响， 6 h后开始出现变化，1 d时正交1，2，3号组大鼠微血管数量与模型组差异有显著性意义(P < 0.05)，且正交3号组更为明显(表3)。2.5 p-ERK表达 免疫组化检测结果显示，造模后，大鼠大脑缺血侧皮质及海马CA1区p-ERK表达水平呈一致性上调，正交1，2，3号组大鼠大脑缺血侧皮质及海马CA1区中p-ERK表达水平较模型组明显上调(P < 0.05)，且正交3号组大鼠大脑缺血侧皮质及海马CA1区中p-ERK表达水平变化更为明显(图2，表4)。3 讨论 Discussion针刺作为治疗脑缺血再灌注损伤疾

32、病的一种非药物治疗手段，可有效地改善脑缺血的症状及预后9。实验采用正交实验对近年来报道较为有效的穴位，在中医基础理论的指导下，重组优化得到的3号组穴配方合谷、尺泽、足三里及三阴交，是手阳明和手太阴相配，足阳明和足太阴相配，取其气血阴阳同补之意，迎合表里配穴法，彰显针灸辩证论治的优势。四穴相配可起到醒脑开窍、舒经活络、平肝熄风、祛瘀化痰的作用，是脑卒中治疗最常选取的基础穴。缺血再灌注后72 h，正交1，2，3号组大鼠神经行为学评分均与模型组差异有显著性意义(P < 0.01)，且正交3号组大鼠神经行为学评分低于正交1，2号组(P < 0.05)，且72 h后正交3号组大鼠的5959I

33、SSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH表1 电针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能缺损评分的影响 (±s，n=30)Table 1 Effects of electroacupuncture on the neurological function defect scores of rat models of cerebral ischemia-reperfusion injury表注：与模型组相比，aP < 0.05，bP < 0.01；与正交1，2号组相比，cP < 0.05；与假手术组相比，dP < 0.01。组

34、别再灌注后时间2 h6 h1 d3 d1周假手术组00000模型组2.78±0.44d2.70±0.48d2.67±0.5d2.38±0.52d2.25±0.71d正交1号组2.78±0.44d2.63±0.52d2.25±0.71ad1.86±0.69ad1.75±0.71ad正交2号组2.75±0.46d2.56±0.53d2.18±0.74ad1.95±0.46ad1.84±0.38ad正交3号组2.70±0.48d2.33

35、77;0.71ad2.00±0.50ad1.63±0.52bcd1.44±0.53bcd表2 电针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗死面积的影响 (±s，n=30，mm3)Table 2 Effects of electroacupuncture on the infarct volume of rat models of cerebral ischemia-reperfusion injury组别再灌注后时间2 h6 h1 d3 d1周假手术组00000模型组223.78±31.44d220.37±27.48d216.13±3

36、6.71d205.45±32.52d173.27±19.71d正交1号组219.78±23.44d213.63±25.52d211.34±34.65d191.27±23.69acd162.75±23.71acd正交2号组220.25±29.46d218.56±31.53d213.38±32.74d193.25±36.46ad159.14±27.38ad正交3号组223.70±26.48d216.33±28.71d155.54±26.50ad136

37、.63±28.52bcd121.44±23.53bcd表注：与模型组相比，aP < 0.05，bP < 0.01；与正交1，2号组相比，cP < 0.05；与假手术组相比，dP < 0.01。表3 电针对缺血再灌注大鼠脑缺血区微血管密度数量的影响 (±s，n=30，n/400倍视野)Table 3 Effects of electroacupuncture on the number of microvessel density in the ischemia region in rats after cerebral ischemia-r

38、eperfusion injury组别再灌注后时间6 h1 d3 d1周假手术组0.72±0.180.75±0.160.68±0.200.77±0.14模型组3.37±1.484.88±2.337.54±1.349.10±3.28正交1号组5.63±1.5216.67±2.54a20.39±2.01a29.00±3.17a正交2号组6.56±1.3416.98±2.12a23.14±2.07a31.11±2.98a正交3号组6.33&#

39、177;2.7117.88±2.25ab24.87±2.13ab33.25±2.45ab表注：与模型组相比，aP < 0.05；与正交1，2号组相比，bP < 0.05。表4 针对缺血再灌注大鼠大脑缺血侧皮质及海马CA1区中p-ERK表达水平的影响 (±s，n=30，灰度值)Table 4 Effects of electroacupuncture on the p-ERK expression level in the cortex and hippocampal CA1 region of ischemic hemisphere in r

40、ats after cerebral ischemia-reperfusion injury组别再灌注后时间2 h6 h1 d3 d1周假手术组201.48±23.71208.71±25.72207.82±22.18205.34±25.21204.33±24.12模型组158.52±21.30a149.21±22.11a137.61±20.54a131.45±25.21a143.32±23.23a正交1号组167.21±21.10a155.45±23.12a145.12

41、77;21.34ab149.31±24.32ab163.42±21.33ab正交2号组160.33±21.13a184.12±24.22ab154.32±24.22ab168.12±23.12ac176.33±21.23ac正交3号组171.58±27.26a202.13±24.43ac213.58±23.54acd221.53±24.55acd229.43±23.31ace表注：与假手术组相比，aP < 0.01；与模型组相比，bP < 0.05，cP <

42、 0.01；与正交1，2号组相比，dP < 0.05，eP < 0.01。脑组织梗死面积也低于模型组和正交1，2号组。ERK是MAPK家族重要成员之一，主要分布于胞浆中，接受NGF-Ras-Raf-MEK顺序激活转至胞核，对转录因子磷酸化而调节转录活性，促进神经元作出相应的反应，EPK还可被多种刺激(如神经递质、氧应激、缺血等)激活，Beretta等10研究发现，MEK-ERK1/2和ERK1/2MAPK是其保护作用细胞外信号传导的重要机制。研究证实，在大鼠脑缺血再灌注模型中，缺血耐受性强的海马CA3/DG区ERK活性增强较缺血敏感的CA1区明显，且随缺血后再灌注时间的延长CA3/

43、DG区ERK的活性有所降低，但在再灌注24 h后仍高于对照水平，而CA1区ERK活性随再灌注时间延长，很快就降至对照水平以下。同时观察到CA3/DG区相对分子质量为180 000的生长因子受体的磷酸化在缺血再灌注后24 h持续增加，此变化可能是ERK水平的升高所引起的神经胶质细胞释放生长因子所致。因此可以看出在大鼠缺血再灌注损伤时ERK活性的增加是针对缺血缺氧刺激启动的修复和促进细胞存活的保护机制，对发生缺血损伤的神经元有保护作用11-13。实验结果显示，正交3号组大鼠在提高信号通路表达方面起到的作用较其他两组显著，表明电针刺激相关穴位可以有效改善大脑梗死后脑组织的缺血情况，促进梗死区域血管的

44、再生，而这些作用跟激发脑缺血再灌注后的信号通路的表达关系密切。说明电针刺激由正交试验优化组穴配方的在治疗卒中后遗症方面效果显著，证明该选穴方法的科学性和有效性；就该组穴治疗脑缺血再灌注损伤疗的效机制来讲，仅对单一一条信号通路的影响是否可以起到对脑组织的保护作用还有待进一步证实，而该组穴的深一层次的疗效机制还需要做更深一步的研究。作者贡献：所有作者均参与本次研究，通讯作者参与评估。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验方案经广西医科大学动物伦理委员会批准。实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录