神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究

1、神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究         【摘要】  目的观察神经干细胞静脉移植对损伤大鼠脊髓功能的治疗作用。方法取孕1416 d SD胎鼠的脑室下区组织，体外培养后鉴定细胞。制作脊髓全切模型，伤后1周将Brdu标记好的神经干细胞通过尾静脉注射移植到大鼠体内，移植后及8周行皮层体感诱发电位（CSEP）检测和BBB功能评分，并留损伤脊髓处作病理切片及免疫组化染色。结果（1）移植后8周BBB评分损伤组、移植组都有所恢复，但都未达到正常水平，移植组恢复较好；（2）模型制作后，CSEP波均消失，细

2、胞移植后8周移植组的波形有不同程度的恢复，但潜伏期延长；（3）移植组大鼠脊髓损伤处存在大量Brdu染色阳性细胞，表明移植的细胞在体内可到达损伤脊髓处并能存活；脊髓损伤部位NF-200及GFAP染色阳性的细胞表明移植的细胞可以分化为具有神经元和胶质细胞特性的细胞。结论静脉移植的神经干细胞能到达损伤区代替受损的神经元及神经胶质细胞，使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。 【关键词】  脊髓损伤； 神经干细胞； 静脉移植； 功能恢复脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后自身的修复能力非常有限，死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neu

3、ral stem cells，NSCs)的研究改变了这一观点。神经干细胞1,2是一类存在于中枢神经系统内具有多向分化能力的细胞，能分化成少突胶质细胞、神经元、星形胶质细胞。人们已经把神经干细胞视为治疗脊髓损伤的理想移植细胞。神经干细胞移植治疗脊髓损伤的途径可分为2种：(1)移植物直接植入脊髓损伤部位，此法可导致局部移植物的高密度存在，有利于局部神经纤维的再生;(2)移植物通过血液循环系统到达损伤部位。有关报道表明神经干细胞可以通过损伤部位的血脑血脊髓屏障到达损伤部位从而修复损伤3。本实验旨在研究神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的疗效，为临床进一步治疗脊髓损伤提供科学依据奠定基础。1 

4、材料与方法1.1  免疫组化试剂化学试剂5-溴脱氧尿核苷(Brdu)、小鼠抗Brdu单克隆抗体购于Sigma公司；小鼠抗巢蛋白(nestin)多克隆抗体购于Chemicon公司；小鼠抗胶质细胞酸性蛋白(GFAP)IgG1、小鼠抗神经元丝蛋白(NF-200)IgG1及FITC标记的羊抗IgG1购于武汉博士德公司；亲和素标记的Cy3购于KPL公司；细胞因子EGF、bFGF均购于Pepro Tech EC公司。1.2  胎鼠来源的NSCs的制备、培养、分化与鉴定41.3  脊髓损伤模型的制备1.4  NSCs的静脉移植1.5  BBB功能评分8评价大

5、鼠下肢功能行为学检测参照Basso等提出的大鼠SCI后功能评判标准(简称BBB评分法)对各实验动物后肢的运动功能进行评分。所有观察都在上午进行，评分前应将所有动物的膀胱排空，时间为4 min，评分时采用双盲法。1.6  动物皮层体感诱发电位(CSEP)的测定9模型动物在术后1 d及9周行CSEP检查。每只动物均测双下肢。1.7  组织免疫组化检测试验大鼠在移植8周后过度麻醉并作4多聚甲醛灌注。取出脊髓，4PFA固定后作石腊切片。1.8  统计学处理所有数据采用SPSS 12.0程序分析，P0.05为差异显着。2  结果2.1  神经干细胞的培养

6、、分化和鉴定情况2.3  神经干细胞的分化能力鉴定神经干细胞具有多分化潜能，能够分化出神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。神经元丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)分别是神经元和星形胶质细胞特异性抗原标志。为了证实神经干细胞的多分化潜能，神经干细胞在撤掉丝裂原并加入血清分化1周，对分化细胞进行免疫组织化学鉴定。实验发现，分化的细胞中有NF和GFAP阳性的细胞(图5、6)。         2.4  CSEP测定9所有实验动物在术前、术后1周及术后9周作CSEP测定。大鼠CSEP的波

7、形为“W”形，所有大鼠在术前和A组术后的潜伏期正常；术后1周，B组和C组的CSEP消失，移植后8周B组的波形仍无，C组的波形恢复，但潜伏期延长(P0.05)，提示脊髓传导速度明显下降。表明移植NSCs治疗使动物损伤脊髓的传导功能有明显改善，但仍未恢复到大鼠未受损前的水平。各组的CSEP及潜伏期见表1。表1  各组动物的皮层体感诱发电位潜伏期（略）2.4  功能评价表2  各组动物的BBB评分结果（略）*P0.01 vs A；#P0.05 vs B2.5  组织免疫组化结果    神经干细胞在损伤脊髓内的存活、迁移及分化在荧光

8、显微镜下观察，可见神经干细胞移植组的脊髓损伤附近有大量被Brdu标记的移植细胞。损伤组中未见Brdu阳性的神经干细胞，nestin阳性的细胞较少的散在于病灶之中(图7)，NF-200阳性的神经纤维较少，GFAP阳性的再生神经纤维数量亦较少。移植组中可见Brdu阳性的神经干细胞分布于损伤区并向两侧延伸，在脊髓横断邻近的约1个节段移植细胞呈散在分布。在远离横断处的脊髓内移植细胞主要分布于白质中，排列较整齐，与脊髓纵轴平行，大量NF阳性的神经纤维及GFAP阳性的再生神经纤维分布其中。移植组大鼠脊髓损伤处存在大量Brdu和nestin双标染色阳性细胞(图8)，表明移植的细胞在体内可以到达损伤脊髓处并能

9、存活；脊髓损伤部位Brdu和NF-200(图9)及Brdu和GFAP(图10)双标染色阳性的细胞表明移植的细胞可以分化为具有神经元和胶质细胞特性的细胞，其中GFAP阳性细胞多于NF-200阳性细胞。3  讨论   NSCs的移植被认为是修复SCI最有希望的治疗方案。McDonald等10实验证明，小鼠胚胎NSCs植入损伤的大鼠脊髓后，植入细胞存活，并分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元,且能从损伤处向周围迁移，使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。表明移植的NSCs能够替代损伤、死亡的神经元，重建神经元回路，并在脊髓损伤部位起连接中断的作用。NSCs移植到脊髓受

10、损部位后，能够分泌大量的治疗性因子，以防止神经元死亡并促进神经再生。因此，不管何种途径被移植到损伤大鼠体内的干细胞要求能够到达损伤部位并能存活相当长的时期，与宿主脊髓组织整合。被横断的脊髓在损伤后将出现急性炎症反应11，有神经毒性的炎症因子含量急剧升高，如IL-6、IL-1、TNF-等，可引起脊髓残端变性、坏死和空洞形成而产生脊髓损伤后自切现象，这一过程需要1周左右。在损伤后1周内进行移植会出现移植细胞的坏死现象；如在损伤后较长时间移植，神经纤维再生很难通过胶质瘢痕；一般认为在损伤后1周左右移植可以阻碍胶质组织瘢痕生成，利于移植物的生长。为此本实验以伤后1周作为细胞移植时间。Sufan等12把

11、从大鼠胚胎(E16)海马中分离出含有NSCs的神经球注入第四脑室中，通过脑脊液转运，在损伤脊髓处的软脊膜形成细胞群，并扩散至脊髓、神经根。植入的NSCs良好地整合到宿主脊髓中，在脊髓中它们像星形胶质细胞伸出突起包被神经纤维，在神经根处则像雪旺细胞一样包被有髓纤维或整合到无髓神经束中。Kon Chu7等把体外培养的人神经干细胞通过尾静脉移植到大鼠脑缺血模型，发现移植细胞能够通过血液循环和血脑屏障到达损伤病灶处存活、分化，使动物缺血的症状得到一定的改善。并在动物的肾脏、肺、脾脏内发现移植的细胞，通过常规组织学检查并未发现组织破坏现象和新生物形成。由此可见神经干细胞具有极低的免疫原性，几乎不引起宿主

12、的排斥反应。本实验采用神经干细胞悬浮球培养方法和Nestin抗体鉴定相结合，成功建立神经干细胞体外培养体系。将培养的神经干细胞通过静脉移植入损伤大鼠体内，结果发现接受神经干细胞移植的大鼠脊髓功能恢复明显优于损伤组，至移植后第8周评分发现，静脉移植组平均得分高于损伤组2.80分，经统计学检验差异有显着性意义，说明神经干细胞移植治疗可以显着促进损伤脊髓的功能恢复。细胞移植后及移植后8周的双下肢CSEP的测定也同样证明了这一点。同时，免疫组织化学检测证实移植的细胞能够通过血管系统和血脑屏障到达损伤脊髓部位存活并在损伤部位可以分化为神经丝蛋白抗体(NF-200)及胶质原纤维酸性蛋白抗体(glial f

13、ibrillary acidic protein，GFAP)染色阳性的细胞，也证实了移植的细胞可以分化为具有神经元或胶质细胞特性的细胞。这都说明移植的神经干细胞促进了损伤的脊髓组织修复，与脊髓功能的恢复相对应。神经干细胞移植促进损伤脊髓功能恢复的机制还不十分清楚，可能有以下三点：（1）神经于细胞分化后产生的神经元和胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达，使损伤轴突开始再生。它们同时产生多种细胞外基质，填充脊髓损伤后遗留的空腔，为再生的轴突提供支持物；（2）补充外伤后缺失的神经元和胶质细胞；（3）使残存脱髓鞘的神经纤维和新生的神经纤维形成新的髓鞘，保持神

14、经纤维功能的完整性。未来的研究方向有：植入的神经干细胞在损伤的脊髓中最终分化的命运和从血液到达脊髓损伤局部的机制；损伤的脊髓局部环境影响神经干细胞命运的分子机制和静脉移植与局部移植相比较的疗效差异等。本实验所取得的结果有了一个好的开始，相信不久的将来，神经干细胞移植最终能够成为治疗临床脊髓损伤患者的有效方法。(本文附图见加页2)（略）【参考文献】  1 Villa A,Snyder EY, Vescovi A,et al.Establishment and properties of a growth factor dependent perpetual neural stem ce

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