花生丝核菌叶枯病的鉴定_肖翔

1、花生丝核菌叶枯病的鉴定肖翔,易赛,张淑娟,徐大高,纪春艳,何艺郡,潘汝谦(华南农业大学资源环境学院广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室,广东广州510642摘要:近年来在广东局部地区发现一种严重危害花生叶部的病害,该病害主要病症为在叶部形成水渍状病斑,并导致叶片枯死,严重影响花生植株生长。在病叶的病健交界处分离获得一真菌,该真菌菌丝宽度为5.512.3m,近直角分枝,分枝处缢缩,近分枝处有隔膜;菌丝细胞核数目为39个,多为47个;产生褐色不规则形状菌核,外表粗糙,长宽范围为0.926.12mm×0.744.96mm。该菌被鉴定为茄丝核菌(Rhizoctonia solani K&

2、#252;hn,有性态为Thanatephorus cucumeris(Genbank登录号分别为KF053534、KF053535和KF053536,获得的序列与GenBank中已报道的茄丝核菌(R.sonaliAG-1融合群的菌株E53、YN-1和H5-526(Genbank登录号分别为KC285892、KC285893和AY154301同源性高达99%100%。离体叶片和盆栽接种,均获得与田间相似的症状,并在罹病叶片上再次分离到同一种真菌。该病害被定名为花生丝核菌叶枯病。关键词:花生;丝核菌叶枯病;茄丝核菌中图分类号:S435.652文献标识码:A文章编号:1004-874X(20132

3、2-0090-04 Identification of peanut Rhizoctonia foliar blightXIAO Xiang,YI Sai,ZHANG Shu-juan,XU Da-gao,JI Chun-yan,HE Yi-jun,PAN Ru-qian (College of Natural Resources and Environment Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control,South China Agricultural University,Guangz

4、hou510642,ChinaKey words:peanut;Rhizoctonia foliar blight;Rhizoctonia solani花生(Arachis hypogaea L.是广东省重要的经济作物和油料作物。2010年广东全省花生种植面积达32.85万hm2,总产量为87.13万t。而花生病害已成为影响花生产量的重要因素之一1。广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室于20112012年于广东地区发现一种花生叶部病害,该病害主要造成花生叶片变褐枯萎,严重影响花生植株生长。我们对该病害症状进行描述,并通过病原物的分离培养、形态学观察、生物学性状研究、致病性测定及病菌基因组中

5、ITS序列检测分析,对病原菌进行鉴定,以期为该病害的防控提供科学依据。1材料与方法1.1试验材料收稿日期:2013-07-07基金项目:广东省科技计划项目(2011B020308013作者简介:肖翔(1988-,男,在读硕士生,E-mail:superwcboy 90供试花生品种为仲恺花99,由仲恺农业工程学院郑奕雄教授提供。1.2试验方法将病原菌菌株接种至PDA平板,并以45°角将盖玻片插入PDA培养基中,于25黑暗条件下培养;待菌丝生长至盖玻片的1/3处,轻轻取出盖玻片,置于载玻片上,于光学显微镜下(400×用测微尺测量菌丝宽度并观察菌丝形态,每个玻片测10个菌丝的宽度

6、,设置3个重复,并求出平均值。同时用番红O-KOH染液对菌丝染色23min后盖片观察,每个玻片测10个细胞的细胞核数,设置3个重复,并求出平均值2。将病原菌菌株移至PDA平板上活化后,用打孔器从菌落边缘打取菌饼(直径0.5cm,接种至PDA平板中央,置于25黑暗条件下培养,24h后用直尺测定菌落直径,并计算菌丝每小时的生长速率,设置3个重复。菌落直径测量后,各菌落置于相同条件下继续培养2周,观察记录菌落颜色和形状、菌核颜色变化及菌核在菌落上形成的形状。同时收集每个培养皿(直径9cm,培养基约15mL中的所有菌核:测定菌核的数量;在显微镜下(40×用测微尺测量菌核的大小,较大的菌核用游

7、标卡尺进行测量(随机测量30个菌核;将所有菌核置于50下烘干后,称量每皿菌核的总干重,并根据每皿的菌核数换算成单个菌核干重。2结果与分析2.1症状该病害在花生各生育期均可造成危害,以成株期发生为主。苗期为害,可导致幼苗茎基部腐烂和立枯。成株期危害,主要侵染花生的复叶,包括小叶片、叶柄、叶枕和托叶等部位。受害小叶片早期形成不规则水渍状病斑,浅褐色、暗褐色至黑色。高湿条件下,病斑扩展迅速,整个小叶片变黑褐色腐烂并下垂。在天气干燥时,病斑停止扩展,形成边缘明显的褐色或黑褐色枯死斑,病斑中央灰白色;枯死的病小叶常常卷缩。病叶间常有菌丝相连,致使病叶常不脱落。叶柄、叶枕和托叶受害后变褐色或黑褐色腐烂。由

8、于病原菌的菌丝体沿茎干攀援,因此,在接近茎干的叶柄基部和托叶常常容易受害。潮湿条件下,常可见稀疏的白色至褐色的菌丝体平铺在罹病叶片上。后期于罹病部位可形成白色至褐色半球状菌核(图1,封二,菌核表面粗糙;菌核由菌丝联系附着在植物表面,易脱落。病害在田间常常有明显的发病中心。在惠州市、河源市和阳江市等地均有分布。在邻近广东的江西赣州也有分布。2.2病原菌的形态和生物学性状病原菌在PDA培养基上形成圆形菌落。菌丝初期白色,后转为浅褐色。菌丝粗壮,宽度为5.512.3m。菌丝近直角分枝,分枝处缢缩,近分枝处有隔膜(图2C,封二。菌丝生长迅速,平均生长速率介于2.02.3 mm/h。菌丝细胞均为多核,细

9、胞核数目为39个,多为47个。病原菌不产生分生孢子,能形成白色至褐色的菌核,每皿产菌核1634个,靠近培养皿中央分布(图2A,封二。菌核形状不规则,长宽范围约为0.926.12 mm×0.744.96mm,单菌核干重为1.783.77mg,菌核表面粗糙(图2B,封二。根据形态特征,将该病原菌鉴定为茄丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn3。2.3病原菌的致病性鉴定离体叶片接种试验中,保湿2d后,接种叶片上铺满白色至浅褐色菌丝,小面积叶面变褐;保湿4d 后,接种叶片部分区域变黑,菌丝增多;保湿7d后,多数接种叶片大面积变黑腐烂,部分菌丝体纠结成91M123CK

10、2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM:DL2000Marker;1-3:菌株JXWD5,菌株GDHZ12,菌株GDHY38;CK:阴性对照图3菌株ITS序列PCR电泳图谱图4基于ITS 序列构建的病原菌的系统发育树白色小团并形成褐色菌核。盆栽植株接种试验中,接种后2d后,接种处长出菌丝,并延枝条延伸;接种后4d,叶芽处产生小型不规则病斑,菌丝延伸至顶部;接种后7d,部分叶片及枝条基部变褐腐烂;接种后14d,大部分叶片枯萎脱落,部分枝条枯萎,并于受害叶片上形成白色至褐色菌核。接种试验结果表明发病症状与田间观察症状一致。从接种叶片及接种植株上再次分离到的病菌与供试菌株

11、培养性状及形态特征一致,经柯赫氏法则验证,确认供试菌株为该病害的病原菌。2.4病原菌的分子鉴定采用真菌ITS区域通用引物ITS1和ITS4对代表性菌株JXWD5、GDHZ12及GDHY38的ITS序列进行扩增,获得大小约为700bp的DNA片段,测序结果表明该片段实际大小为720bp(图3。将测序后的病原菌ITS序列提交至GenBank数据库(登录号分别为KF053534、KF053535和KF053536。将获得的病原菌ITS序列和GenBank中已报道的ITS序列比对,结果表明:病原菌菌株ITS序列与已知的茄丝核菌(R.sonali AG-1融合群的菌株E53、YN-1和H5-526(Ge

12、nBank 登录号分别为KC285892、KC285893和AY154301同源性高达99%100%。从系统发育树(图4可以看出,菌株GDSH12和GDSH38与茄丝核菌(R.solaniAG-1融合群的菌株E53、YN-1及H5-526聚在一个末端聚类簇上;菌株JXWD5与这3个菌株相邻,但与茄丝核菌(R.Solani AG-1融合群的菌株在同一分支上。茄丝核菌(R. solaniAG-4融合群的菌株分属于不同分支。结果表明病原菌属于茄丝核菌AG-1融合群。3结论与讨论早在1976年,广东电白县发生花生纹枯病,该病的症状与水稻纹枯病的症状极为相似,病原菌被鉴定为水稻纹枯病菌Pellicula

13、ria sasakii(ShiraiIto,无性阶段为丝核菌(R.solani Palo4。在南方地区,张晓葵等51983年报道湖南湘潭和益阳等地由水稻纹枯病菌(R.solani kühn引起花生纹枯病日益严重;唐乾忠61985年报道四川合江县花生纹枯病日趋严重;孙晓阳71993年报道花生纹枯病是四川南部县新上升的病害;但是,这些报道都没有进行病原菌的鉴定。孟宪曾81985年也引用了广东农林学院的材料,记载了由佐佐木薄膜革菌P.sasakii(ShiraiIto引起的花生纹枯病。张明厚91996年将花生纹枯病的病原菌记载为瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris(Fra

14、nkDonk,无性阶段为立枯丝核菌(R.solani Kühn。茄丝核菌过去被称为立枯丝核菌。因为茄丝核菌引起水稻纹枯病,因此又被称为水稻纹枯病菌。但将茄丝核菌引起的花生叶部病害称为“花生纹枯病”,这个名称其实并不贴切,不宜继续使用。因为,茄丝核菌在花生的叶片上的病斑是叶部组织的快速死亡,并没有“纹枯”的症状特征。在我国北方,1976年在辽宁省的旅大地区,首次发现由丝核菌引起的花生叶腐病,但是,没有对病原菌进行鉴定10。杜化仿等11也使用了花生叶腐病这个名称。Yan等122013年报道,茄丝核菌(R.solani的AG-1-IA融合群引起花生叶腐病(peanut leaf rot。从

15、这些报道来看,花生叶腐病这个病害名称反映了病害症状的主要特点。徐秀娟等13报道由丝核菌属(Rhizoctonia sp.引起的花生菌核病,病害主要危害叶片,产生不规则的水渍状病斑,导致大量落叶;病组织上有白色菌丝和黑褐色不规则形状的菌核。徐秀娟等14-15进一步鉴定了花生菌核病的病原菌是立枯丝核菌(R.solani,有性态是瓜亡革菌(T.cucumeris。但是,徐秀娟等强调该病害与孟宪曾描述的花生纹枯病不同,并且与由茄丝核菌引起的花生立枯病和叶腐病也不同:叶腐病的病原菌的菌丝体分支多为直角,27下,在PDA培养基上形成菌核的时间为57d;而菌92核病的菌丝分支多为锐角;25下,在PDA培养基

16、上形成菌核的时间为3d。鄢洪海等16则将花生菌核病这个病害称为叶部菌核病,强调该病害主要危害叶部。从这些报道来看,花生菌核病或者花生叶部菌核病的症状和花生叶腐病是相似的。国外的研究表明,茄丝核菌(R.solani在花生的任何部位均可危害,以枝腐(limb rot为主,在叶片上的病害被称为叶枯病(foliar blight17-19。本文所报道的病害主要危害花生叶片,导致大量叶片快速枯死,根据这一特征,参考国外的病害名称,我们将该病害鉴定为花生丝核菌叶枯病(Rhizoctonia foliar blight of peanut。美国报道花生枝腐与叶枯病的病原菌主要是茄丝核菌的AG-4融合群18,

17、20。Yan等12报道在山东省引起花生叶腐病的茄丝核菌为AG-1-IA融合群。本研究结果表明广东花生丝核菌叶枯病的病原菌与茄丝核菌的AG-1融合群同源,但该菌是否为茄丝核菌的AG-1融合群还需通过试验进一步确认。参考文献:1郑奕雄.南方花生产业技术学M.广州:中山大学出版社,2009:1-38,236-248.2黄江华,杨媚,周而勋,等.丝核菌细胞核染色技术的研究J.仲恺农业技术学院学报,2001,14(4:13-17.3陆家云.植物病原真菌学M.北京:中国农业出版社,2001:360-363.4广东农林学院植物病理学教研组.经济作物病害防治M.广州:广东人民出版社,1977:28-32.5张

18、晓葵,刘玲.水稻纹枯病菌危害玉米、大豆、花生的情况及防治建议J.湖南农业科学,1983(2:45-46.6唐乾忠.花生纹枯病的防治J.四川农业科技,1985(3:26-27.7孙晓阳.花生纹枯病发生规律与测报技术初探J.云南农业大学学报,1993,8(3:144-145.8孟宪曾.花生病害M.北京:农业出版社,1985:92-94.9张明厚.油料作物病害M.北京:中国农业出版社,1995:174-175.10中国科学院林业土壤研究所和二十里堡公社农业站.花生叶腐病J.新农业,1978(15:13.11杜化仿,张茹琴,夏淑春,等.花生叶腐病菌毒素提取及致病性研究J.青岛农业大学学报(自然科学版,

19、2011,28(2: 99-102.12Yan H H,Zhang R Q,Du H F,et al.Rhizoctonia solaniidentified as the disease causing agent of peanut leaf rot in ChinaJ.Plant Disease,2013,97(1:140.13徐秀娟,迟玉成,宋文武,等.花生菌核病的研究J.花生科技,1999(S:430-432.14徐秀娟,赵志强,宋文武,等.花生菌核病及其防治研究J.山东农业大学学报(自然科学版,2003,34(1:33-36. 15徐秀娟,赵志强,王佩圣,等.花生菌核病病原分类及其特性研究J.广西农业科学,2004(3:211-212.16鄢洪海,赵志强,卢钰,等.花生叶部菌核病流行规律及生物防治初报J.花生学报,2006,35(3