苏丹红I直接竞争ELISA检测方法的研究

1、苏丹红I直接竞争ELISA检测方法的研究        【摘要】     苏丹红的快速检测方法是应用于快速、高效的检测食品中苏丹红含量的有效方法，利用本实验室获得的苏丹红I单克隆抗体，合成了HRP酶标记苏丹红I抗体，同时合成了HRP酶标记苏丹红I抗原, 分别建立了苏丹红I直接竞争ELISA的检测方法，为苏丹红I的快速检测方法提供了依据。     【关键词】  苏丹红; 直接竞争;ELISA;检测  

2、;  苏丹红是一种人工合成的红色亲脂性偶氮化合物，主要包括，和 4种类型，常应用于诸如油彩、蜡、地板蜡和香皂等化工产品中的一种非生物合成着色剂，一般不溶于水，易溶于有机溶剂14。苏丹红是一种工业染料，中国和欧盟等全球多数国家都禁止苏丹红用于食品生产3。目前苏丹红检测的方法包括国标的检测法都比较耗时，毒性较大5，6，采用苏丹红I单克隆抗体连接HRP酶制成酶标抗体，以及苏丹红I抗原上连接HRP酶，进行苏丹红的直接竞争ELISA法检测，能简化间接竞争ELISA操作步骤，达到快速检测的目的，具有较广阔的应用前景。1材料苏丹红I单克隆抗体、羧基化苏丹红I由本实验室自制;辣根过氧化物酶

3、(HRP)，生化试剂，上海源聚生物科技有限公司;高碘酸钠，硼氢化钠均为sigma公司产品;Amersham Bioscience蛋白纯化系统;酶标仪Thermo Multiskan MK3;Costar96 孔酶标板购自上海;移液枪，eppendorf公司;紫外分光光度计购自美国PerkinElmer公司。2方法2.1抗体的纯化取1 ml腹水，在10 000 r/min，4离心10 min，去细胞残渣及脂肪，加入2 ml，0.06 mol/L，pH5.0乙酸buffer，用0.1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH调pH至4.5，逐滴加入辛酸，每1 ml腹水加33 l，室温搅拌30

4、min，4静置2 h，然后离心，4 10 000 r/min 离心30 min，弃沉淀，用0.45l滤膜过滤，上清加1/10体积的pH 7.4 0.1 mol/L PBS，用1 mol/L的NaOH调pH至7.4，于4冰浴中，30 min内加入0.277 g/ml的(NH4)2SO4，使之达到45%饱和度，静置过夜，4 5 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀溶于PBS中，透析后即得到纯化的抗体。2.2HRP酶标苏丹红I抗体的制备称取5 mg HRP，溶于0.5 ml水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的NaIO4 0.5 ml,置冰箱30 min，然后取出加入0.06 mol

5、/L乙二醇水溶液0.5 m l，室温放置30 min，加入含5 mg抗体的水溶液1ml，混匀并透析，用0.05 mol/L,pH9.5碳酸缓冲液搅拌透析6 h，吸出加入5 mg/ml NaBH4，0.2 ml冰箱放置2 h1，最后用凝胶层析过滤的方法，将酶标抗体分离出来。2.3HRP酶标苏丹红I抗原的制备苏丹红I-BSA抗原的制备， 8.2 mg/ml BSA 0.5 ml加入5个不同浓度的羧基化苏丹红I(浓度分别为0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 mg/ml)各0.5 ml，再加入EDAC 1 mg，16反应4 h，用纯净水透析过夜回收，加粉末状NaHCO3调至

6、pH8.5备用，紫外扫描，根据其在280 nm和486 nm的吸光值、苏丹红I和蛋白质在这二种波长下的摩尔消光系数，按公式按公式CSudanI/CBSA=(OD280×KBSA，486-OD486×KBSA，280)/(OD486×KSudanI，280-OD280×KSudanI，486)计算偶联产物的摩尔比7。称1.5 mg HRP溶于0.15 ml水中，加入0.04 M NaIO4 0.15 ml，冰箱放置30 min，加0.16 M 乙二醇0.5 ml放置30 min，分别加入5种苏丹红I-BSA抗原 0.5 ml，16摇床反应4 h，用0.1

7、mol/L NaHCO3溶液透析过夜，取出即为制好的HRP酶标记的苏丹红抗原。2.4标准曲线的建立采用方阵滴定的方法确定最佳的抗原包被浓度、抗体包被浓度，以及酶标抗体及酶标抗原的使用浓度，建立苏丹红I直接竞争ELISA 的标准曲线。3结果3.1纯化抗体浓度的确定采用紫外分光光度计扫描估算抗体的浓度，并用方阵滴定的方法确定抗体的效价。酶标记所用的抗体浓度为5 mg/ml,抗体效价为164 000。3.2HRP酶标苏丹红I抗体层析分离图谱图1是采用Amersham Bioscience蛋白纯化系统，将酶连接抗体，未连接的酶和抗体用葡聚糖凝胶分离的图谱，其中403 nm是HRP的吸收峰，280 nm

8、是蛋白质的吸收峰，从图1可知，采用高碘酸钠法酶标记抗体，凝胶层析分离首先分离出来的是已标记上的抗体，然后分离出未连抗体的酶，即在170175 min内收集到是HRP标记的抗体，在201205 min内收集到是未标记上的HRP。3.3sudanI-BSA抗原紫外扫描图由图2可知，不同浓度的苏丹红与同浓度的BSA反应，扫描可见产生叠加峰，对照图3中的苏丹红和BSA紫外扫描图可以明显看出。也可证明此法将苏丹红与BSA成功相连，为下一步合成酶标记苏丹红抗原作准备。采用高碘酸钠法将5种不同浓度的的苏丹红抗原分别与HRP相连接，ELISA检测其阻断效率，发现4号样品(CSudanI/CBSA=2.091)

9、的阻断率最高，用该样品做标准曲线。图1HRP酶标苏丹红抗体层析分离图谱图2苏丹红-BSA人工抗原紫外描图图3苏丹红和BSA紫外描图3.4标准曲线4讨论近年来，人们对食品安全的意识不断提高，而相继报道的食品安全事件给食品安全检测敲响了警钟，苏丹红就是常见的工业染料用于食品的例子。然而诸多传统的检测方法不仅操作复杂，费时，而且毒性大，价格昂贵。针对以上不足，本实验室尝试用免疫学检测法来检测苏丹红I，首先成功获得了苏丹红I单克隆抗体，在此基础上建立了苏丹红I间接竟争ELISA检测方法，检测范围达到7.8125 ng/ml，然而间接竞争法检测步骤相对较复杂，为了简化苏丹红I免疫学检测方法，我们人工合成

10、HRP酶标苏丹红I抗原及HRP酶标苏丹红I抗体，建立了苏丹红I直接竞争ELISA检测方法。采用化学法将HRP酶标记在苏丹红I抗体上，即保持了酶的活力，又具有抗体的效价，此法合成的HRP酶标记苏丹红I抗体作为直接法检测苏丹红I具有非常大的用途。采用化学法将HRP酶标记苏丹红I抗原，较前面的方法更稳定，保存更简便。图4酶标记抗体法直接竞争检测苏丹红标准曲线图5酶标抗原法直接况争检测苏丹红标准曲线文献报道HRP酶连接蛋白时，HRP与所连接蛋白质量比为12时连接效果最佳8，9，本实验合成HRP酶标苏丹红I抗原时，采用先合成苏丹红I-BSA抗原，苏丹红的量过量，BSA的质量为3 mg，然后用1.5 mg

11、的HRP酶反应，反应体系符合文献数据，然而苏丹红的量本实验采用同时进行5个平行实验来摸索其最佳反应浓度，结果苏丹红浓度为0.0 625 mg/ml时连接效果最佳，BSA与苏丹红I质量比约为1001。从所作标线得知，酶标抗体法IC50较高为322 ng/ml，对于灵敏地检测苏丹红I 不利，分析其原因可能是酶标抗体在实验的过程中抗体效价会有损失，HRP酶连接的量也不多，诸多因素造成了检测的局限性，解决办法是优化HRP酶标抗体的方法，使其检测更灵敏。酶标抗原法IC50为47.5 ng/ml，因为通过BSA与HRP相连，此法可以连接相对较多的酶分子，使其具有更灵敏的检测效果。苏丹红I直接竞争ELISA

12、法检测具有非常大的应用前景，本实验建立了初步的苏丹红I直接竞争ELISA检测方法，后期实验将两种酶标记物(HRP标记苏丹红I抗体，HRP标记苏丹红I抗原)的标记量提高，提高抗体及酶的稳定性，保存效果，为精确、高效和安全地检测苏丹红I提供实验依据。    【参考文献】  1Calbiani F， Careri M， Elviri L, et al. Development and in-house validation of a liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry

13、 method for the simultaneous determination of Sudan I， Sudan II， Sudan III and Sudan IV in hot chilli productsJ. J Chromatogr A，2004，1042(1):123.2Ming Ma， Xubiao Luo， Bo Chen et al.， Simultaneous determination of water-soluble and fat-soluble synthetic colorants in foodstuff by high-performance liquid chromatography-diode array detection-electrospray mass spectrometryJ. Journal of Chromatography A，2006; 1103(1):170.3彭科怀，向仕学，汤晓勤，等.辣椒制品中苏丹红I的极谱法快速测定J.预防医学情报杂志，2005，21:286.4王洋，彭琨，王胜.食品中苏丹红一号的检测方法J.粮油食品科技，2005，13:43.5苏小川，黄梅，甘宾宾，等.调味品辣椒粉和腌料中苏丹红染料的GC-MS分析J.中国卫生部检验杂志，2005，15(9)：1073.6黄曙海，庞维群.苏丹红染