骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

1、骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤【摘要】目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）对脊髓损伤与修复的作用与机制及细胞移植的方法与途径。方法：实验组为将体外培养SD大鼠的MSCs经绿色荧光蛋白（GFP）转染标记后显微注射于脊髓横断模型的脊髓损伤处，并以无血清培养基注射动物为对照组。12周后观察移植细胞的分化情况，并通过行为学、组织学及免疫组化的方法评价脊髓功能变化。结果：实验组MSCs移植12周后，脊髓功能明显恢复。结论：骨髓间充质干细胞移植对脊髓的损伤修复具有明显作用。【关键词】骨髓间充质干细胞；移植；脊髓损伤；细胞培养AbstractObjectiveToinvestigatethemeth

2、odsthathowtheMSCswokonthespinalcordinjury.AndtrytofindthewaystoplantMSCs.MethodsTheMSCsweretransplantedintothespinalcordofSCImodles.Beforethetransplanting,theMSCsweretransfectedwithEGFP.12weeksaftertransplantation,MSCsdifferencewereobserved,SPECT,immunohistochemistryandangiogenesiswereobservedtodete

3、cttheeffectsonspinalcord.ResultsThisexperimentobtainedthehighpureMSCs.TheMSCscanstabilizetospreadthegenerationtocombinethecord.ConclusionThetransplantationusingthecellsprovedthatMSCswasveryusefulintherecoveryofspinalcordinjuryWhichmayallowustorebuildthoseconditionstorepairandregrowthespinalcord.KeyW

4、ordsMesenchymalstemcells;Transplante;Spinalcordinjury;Cultureofcell脊髓损伤的修复是近年热点课题。骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）由于具有较强的增殖能力和多向分化潜能，可用来作为细胞移植的供体细胞来源1。本实验通过将MSCs移植于损伤的脊髓，研究其在缺血微环境下的分化增殖潜能以及其对于脊髓损伤的作用。1材料和方法1试剂与仪器IMDM（IscovesomdifiedDulbeccosmedium），Gibco公司；胎牛血清（FBS）Hyclone公司；分离液，胰蛋白酶和EDTA；可吸收性明胶海

5、绵，南京第三制药厂；戊巴比妥钠，佛山市化工实验厂；0.2%乳酸环丙沙星，北京双鹤制药厂；乳酸钠林格氏液，北京双鹤制药厂；FLUOROGOLD，FLOROCHROME公司；FLUOROGOLD，FLROCHROME公司；PHA-L单抗，兔源性；牛血清白蛋白，SIGMA公司；生物素化羊抗兔IgG，SIGMA公司；EXTRAVIDINPEROXIDASE，SIGMA公司；DAB，SIGMA公司；TRITONX-100，SIGMA公司；葡萄糖氧化酶，SIGMA公司。实验动物，34周龄的SD大鼠，雌雄不限，由中山大学动物实验中心提供。1.2方法数据以均数标准差表示，组间差异采用t检验。2结果2.1大鼠的

6、饲养和护理本组实验用大鼠共16只，对照组8只，术后死亡2只；干细胞移植组8只术后死亡1只。死亡原因为：人工排尿时间和方法错误造成膀胱破裂2只。主要并发尿路感染造成死亡2只。通过规律饮水，人工排尿和局部换药，16只存活情况良好。2.2体重变化由于手术损伤至截瘫后摄食困难所致，在手术后，所有动物均出现体重减轻。在术后3周时，动物的体重减少约2040g。在术后4周时，动物体重逐渐稳步增长。2组体重有明显差异。经统计分析结果如表1。2.3行为学观察术后8周干细胞移植组后肢功能有明显恢复，对照组恢复不明显，只有反射的不自主活动。至第12周，恢复最好的为间充质干细胞移植组的8号大鼠，有频发后肢连续动作，大

7、部分动作前后肢协调，但撑地不连续，后爪起落时有明显的内外旋。BBB分值9.4分；对照组中有23只恢复最差，BBB分值0分；经统计分析，干细胞移植组与对照组有显著差异P0.05。经统计分析结果如表2。2.4组织学观察GFP转染的间充质干细胞在动物体内12W后，表达GFP的细胞大量存在，部分失去间充质干细胞固有的形态（具体分化方向尚待进一步研究），以注射点为中心环行排列并向两端迁移，最远达2cm。表明，间充质干细胞在动物体内存活，并进一步分化，且具有相当的活力可以向远处较长距离的迁移结合示踪观察及行为学测试，更加表明间充质干细胞对于脊髓损伤与修复具有积极作用。在注射点周围，可以观察到大量蓝紫色的为

8、PHA-L所标记的脊髓神经元及神经纤维。除注射点附近外，其区域仅可见标记的神经纤维，未见神经元染色。在上位脊髓白质和灰质中均可见多量被标志的下行神经纤维，在白质中走行较直，而在灰质中走行较为曲折7。在脊髓横断区域，正常的脊髓组织结构中断，代以增生的纤维状瘢痕组织。在瘢痕组织的两侧，脊髓组织的正常结构破坏，代之以胶质增生瘢痕但标记的神经纤维可以通过脊髓横断区界面。在横断处的远侧端可见标记纤维进入脊髓白质和灰质，最远处可达到横断处下位1.5cm处。在有标记的纤维末梢，可以看到呈串珠样的膨体结构。但进一步的结论还需进行更深入的研究，以证实再生纤维和下位神经元形成突触联系。对照组无阳性发现。3讨论不同

9、的实验室获得MSCs的方法不同，但从培养结果来看，所获得MSCs在外部形态上均呈纺锤形的成纤维细胞状，且都能附着在细胞培养基上8。大鼠股骨、胫骨骨髓组织中除含有造血干细胞外，还含有MSCs，它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力又具有多分化的潜能9。分离和纯化MSCs是选择成骨细胞及软骨细胞转化培养过程中的一项重要环节。细胞生物学原理显示接种细胞数量及密度，对细胞增殖和分化特性可产生很大影响。本实验所有动物术后均出现完全性截瘫。本实验动物术后2周内脊髓反射均可逐渐恢复，对照组动物的双下肢运动多数只能停留在反射性动作阶段，间充质干细胞组部分动物8周后出现轻微的下肢活动，我们采用5人组同时观察记

10、分取均植作为BBB评分，结果间充质干细胞组明显优于神经元和对照组；神经元组与对照组比较无统计学意义。顺行示踪标记PHA-L法由Gerfen和Sawchenko于1984年首次报道10。PHA-L法的主要特点有：注射区弥散范围局限；只有注射点的神经元可以摄取足量的示踪剂；细胞体、轴突、树突甚至树突棘均可被标记；即使注射量很少，标记轴突及其终末均可清晰显示，包括终末和细微的侧枝；主要用于顺行示踪，极少逆行标记；不被过路纤维有效转运；在体内不易降解11。分析顺行束路示踪的结果显示：间充质干细胞组在横断处的远侧端可见标记纤维进入脊髓白质和灰质，最远处可达横断处下位2cm处。根据本次实验的结果分析间充质

11、干细胞治疗脊髓损伤的可能机制：具有极低的免疫源性：从细胞分化的角度来看间充质干细胞是一种可向神经组织分化的前体细胞，由于其分化不成熟，成熟抗原不能表达，故不能引起免疫排斥12。替代缺失的神经元：使损伤神经轴索再髓鞘化13。促进受损的神经元轴索再生和神经环路重建：经过体外分离、增殖、诱导的MSCs移植入损伤的动物脊髓内后能从细胞结构上与宿主整和。同时，在生长因子、微环境等信号的作用下，迁移分化为特定的神经细胞，分泌细胞因子，一方面上调与轴索生长相关的基因，促进受损的神经元轴索再生；另一方面，与其他的神经元建立突触联系，重建神经环路，达到脊髓损伤的功能性修复。【参考文献】1许绍芬.神经生物学(第2

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