适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术

1、 乳业科学与技术 2009年第 2期 (总第 135期 综 述! "!"! ! ! ! ! ! "! "乳酸菌是一群形态代谢性能和生理学特征 不完全相同的能发酵碳水化合物产生乳酸的革 兰氏阳性细菌 。 目前在自然界中已发现的乳酸菌 在细菌分类学上可以划分为 43个属,包括 373个种及亚种, 其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧 菌, 乳酸菌的自然宿主是人类 、 动物和植物, 在发 酵过程中的关键代谢产物是乳酸 。 由于其代谢产物对人体健康有益, 所以在各类食品中, 如酸牛 乳 、 干酪 、 巧克力和各类保健药品中得到了广泛 的应用 。分类鉴定是微生物学的一个

2、重要领域, 建立 一套精确快速的分类鉴定方法具有重要的意义 。 传统的微生物分类鉴定方法是利用形态学和生 理学特征及其差异来进行的, 但是这种经典分类 学方法的弊端是耗时耗力, 并且在区分一些形态 相近的菌株方面存在局限性 1。 随着分子生物学 的飞速发展, 从分子和基因水平来鉴定乳酸菌已成为可能 , 许多新的分子生物学技术正在被用来 进行乳酸菌的分类鉴定,如 16S rRNA 基因间隔 区 (Intergenic Spacer Region , ISR 的序列分析技术 、 随机扩增多态 DNA 技术 (Randomly Amplified Polymorphic DNA ,RAPD 、 变性

3、梯度凝胶电泳标 记技术 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis , DGGE 、 限制性片段长度多态性分析技术 (Re -striction FragmentLength Polymorphism , RFLP 、 扩 增片段长度多态性分析技术 (Amplified Fragment Length Polymorphism , AFLP 、 DNA 芯片 技术 、 肠 细菌基因间重复共有序列分析技术 (Enterobacte -rial Repetitive Intergenic Consensus Sequences, ERIC 以 及 重 复 基

4、因 外 回 文 序 列 分 析 技 术 (Repetitive Extragenic Palindromic Sequences, REP 。 本文将就以上几种分子生物学技术的方法 原理以及各自的优缺点进行阐述 。116S rRNA 序列分析原核生物含有 3种类型 rRNA :23S 、 16S 和5S rRNA , 它们分别含有 2,900, 1,540和 120个核 苷酸 。 5S rRNA 虽然容易分析, 但是核苷酸太少, 没有足够的遗传信息用于分类研究; 而 23S rRNA适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术张家超, 孙志宏, 刘文俊, 张和平 *(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教

5、育部重点实验室, 内蒙古呼和浩特 010018摘 要:介绍了几种适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学方法及其原理 、 优缺点和研究现状 。 关键词:分子生物学技术; 乳酸菌; 分类鉴定中图分类号:TS252.1文献标识码:A文章编号:1671-5187(2009 02-0089-05Review on the Molecular Biotechnology for the Classificationand Identification of Lactic Acid BacteriaZhang Jiachao, Sun Zhihong, Liu Wenjun, Zhang Heping*(Key

6、Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education Huhhot ofInner Mongolia 010018, P. R. ChinaAbstract:The principles, methods and applicability of molecular biotechnology used for classification and i -dentification of lactic acid bacteria were reviewed.Key words:molecular bio

7、technology; lactic acid bacteria; classification and identification收稿日期:2008-08-07;作者简介:张家超, 男, 硕士, 研究方向为乳品生物技术; *通讯作 者:张和平, 男, 教授, 博士生导师; 基金项目:国家自然科学基金项目 (30660135, 30760156 , 教育 部新世纪优秀人才支持计划资助项目 (NCET-06-0269 , 国家科 技基础条件平台建设项目 (2005DKA21208-12 。89含有的核苷酸几乎是 16S rRNA 的两倍,分析十 分困难 。 通过大量的研究证明 16S rRNA

8、 的全长 约为 1540bp ,片段长度适中信息量较大且易于 分析 。上个世纪 60年代末, Woese 首次采用寡核苷 酸编目法对生物进行分类, 通过比较各类生物细 胞的核糖体 RNA 特征序列, 认为 16S rRNA 序列 作为微生物分类鉴定的依据最为 合适 。 因为 rRNA 结构既具有保守性, 又具有可变性 。 保守性 能够反应生物物种的亲缘关系; 可变性则能够揭 示出生物物种的序列差异, 是种属鉴定的分子基 础 2。 在对 16S rRNA 序列进行测定后, 可以通过 序列比对分析来完成其种属归类 。近几年, 随着测序技术的日益成熟以及测序 的市场化,使得 16S rRNA 序列分

9、析技术在乳酸 菌鉴定中得到广泛应用 。 P. Parola 等 3应用 16S rRNA 序列分析技术,通过分析序列成功分离鉴 定出了败血病人体内的干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei 。 2002年 Booysen 等 4将分离自麦汁中的乳 酸菌进行了分类研究,通过对其 16S rRNA 序列 分析, 成功的对实验菌株在亚种水平上进行了鉴 定和区分 。 乌日娜等 5结合传统生理生化鉴定方 法与 16S rRNA 序列分析技术将实验室一株益生 菌鉴定为干酪乳杆菌 (L. casei 。 2001年, Corseffi 等 6同样运用 16S rDNA 序列分析技术, 成功的对

10、分离自 25个小麦酸面包中的 317株乳酸菌在种 的水平进行了分类鉴定 。 2000年 Terence R 等 7对 猪排泄物中的一种能够产抗生素的菌株进行了 DNA 序列分析,在分析其 16S rRNA 序列的同时 进一步对其 4232bp 质粒进行分析,最后以 16S rRNA 基因大于 99%的同源性将其鉴定为罗伊乳 杆菌 (L. reuteri 。2随机扩增多态 DNA 技术 (RAPD 随机扩 增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD 标 记 技 术 是 由 Williams 8和 Welsh 同时发展起来的一种分类鉴 定方法

11、 。 它的基本原理是利用随机引物 (一般为 8-10bp 通过 PCR 反应非定点扩增 DNA 片段, 然后应用凝胶电泳分析扩增产物 DNA 片段的多 态性, 来完成其进化遗传分析 。在应用中 RAPD 技术的优点是简单便捷, 在 不知道基因组 DNA 的任何序列信息的情况下就 可以进行鉴定; 缺点是重复性差, 鉴定结果不稳 定, 很难在种以及亚种的水平上准确鉴定 。 2007年 Isabel Lopez 等 9对 120株植物乳杆 菌中的 46株应用传统生理生化方法和 RAPD-PCR 技术进行了遗传学特征分析, 研究结果表明 RAPD-PCR 技术更能显示出这 46株植物乳杆菌 之间的同源

12、性 。 Ulrich Schillinger 等 10从酸乳酪中 分离出 20株益生菌, 使用 RAPD-PCR 技术与 11株模式菌株电泳图谱进行比对分析, 鉴定出这 20株菌属于嗜酸乳杆菌 (L. acidophilus 和干酪乳杆 菌 (L. casei 。 G. Spano 等 11从红葡萄酒中分离出 一株能产生瓜氨酸和氨, 并能起到降低精氨酸作 用的菌株, 经过 RAPD-PCR 技术鉴定为植物乳杆 菌 (L. plantarum 。 Hayford 等 12也用此方法对玉米 发酵进行研究, 发现在玉米发酵中的优势菌种是 发酵乳杆菌 (L. fermentum 。3变性梯度凝胶电泳标

13、记技术 (DGGE 1979年 Fischer 和 Lennan 13最先提出了用于 检测 DNA 突变的一种电泳技术 变性梯度凝 胶电泳 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis , DGGE 技术 。 1993年 Muzyer 等 14首次将 DGGE 技术应用于微生物研究, 并证实这种方法用于微 生物种属鉴定是十分有效的 。DGGE 的基本原理是:DNA 分子中 4种碱基 的组成和排列差异,使不同序列的双链 DNA 分 子具有不同的解链温度 。 当双链 DNA 分子在含 梯度变性剂 (尿素 、 甲酰胺 的聚丙烯酰胺凝胶中 进行电泳时, 因其解链的速

14、度和程度与其序列密 切相关,所以当某一双链 DNA 序列迁移到变性 凝胶的一定位置, 并达到其解链温度时, 即开始 部分解链,部分解链的 DNA 分子的迁移速度随 解链程度增大而减小,从而使具有不同序列的 。 DNA 片段滞留于凝胶的不同位置,结束电泳时, 形成相互分开的带谱 。 理论上认为, 只要选择的 电泳条件如变性剂梯度 、 电泳时间 、 电压等足够 精细,一个碱基差异的 DNA 片段都可以被区分 开 。2007年, Milica Nikolic 等人 15通过 PCR-DGGE 的方法成功鉴定了当地自制山羊奶干酪中的乳酸 菌 。 2006年, G. Spano 等 16运用 DGGE

15、技术成功分析 了红葡萄酒中的酒类酒球菌 (Oenococcus oeni 和植 物乳杆菌 (L. plantarum ,并指出植物乳杆菌 (L. plantarum 是发酵初期的优势菌种 。 Kingsley C Anukam 等 17运用 DGGE 技术和 16S rRNA 序列分 析技术相结合的方法对采自尼日利亚健康女性阴 道的 241株乳酸菌进行了鉴定, 鉴定结果表明惰 性乳杆菌 (L. iners 是优势菌株, 占 64%, 另外有 7.3%属于加氏乳杆菌 (L. gasseri , 有 6%属于植物张家超等:适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术 90 乳业科学与技术 2009年第 2

16、期 (总第 135期 乳杆菌 (L. plantarum , 有 3%属于卷曲乳杆菌 (L. crispatus , 有 2.7%属于鼠李糖乳杆菌 (L. rhamno -sus ,有 2.7%属于阴道乳杆菌 (L. vaginalis , 有 1.3%属于发酵乳杆菌 (L. fermenti , 有 1.3%属于 瑞士乳杆菌 (L. helveticus , 有 1.3%属于唾液乳杆 菌 (L. salivarus 。 Randazzo 等 18也报道了将 DGGE 分析与 RT-PCR 相结合的技术来研究干酪生产 过程中微生物的构成和代谢活性 。尽管 DGGE 电泳技术在研究群落动态和多

17、样性方面存在很多优势, 但是该技术无法给出代 谢活性 、 细菌数量和基因表达水平方面的信息 。 因此必须与其它技术相结合才能弥补不足 。4限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP 上个世纪八十年代, Bostein 19首先提出利用 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (Restriction Fragment Length Polymorphism , RFLP 作为标记构建遗传图 谱 。 RFLP 基本原理是利用特定的限制性内切酶 识别并切割基因组特定片段的 PCR 扩增产物, 得 到大小不等的 DNA 片段 , 通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳分析这些片段, 便可以获得个体的差异, 从而 达

18、到鉴定辨别的目的 。最近几年, PCR 与 RFLP 相结合的技术被普 遍的应用于乳酸菌的分类鉴定中 。 2003年, Elif Yavuz 等 20应用 RFLP 技术对分离自当地的酸酪 中的 150株乳酸菌进行分类研究, 并与九株标准 菌株 RFLP 图谱比较分析,在种的水平上对其进 行了鉴定 。 John W 等 21应用 PCR-RFLP 对拟南芥 中的细菌群落进行了菌群分析, 通过与模式参考 菌株比对, 将分离细菌进行了鉴定, 其中植物乳 杆菌 (L. plantarum 为优势菌群 。 2002年 Giraffa G 等人 22对分离自当地不同乳制品中的 35株德式 乳杆菌 (L.

19、 delbrueckii 和保加利亚乳杆菌 (L. bulgaricus 在亚种水平上进行了鉴定; 并通过比 较使用 RFLP 蛋白基因编码技术与 16S rRNA 序 列分析技术最终得出结论, RFLP 蛋白基因编码 技术在亚种水平的鉴定中较之 16S rRNA 序列分 析技术更为有效 。 Randazzo 等 23应用此技术对分 离自绿橄榄中的部分乳酸菌进行研究, 发现大部 分菌株为干酪乳杆菌 (L. casei 和短乳杆菌 (L. brevis 。5扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP 1993年荷兰科学家 Zabeau 和 Vos 24率先提 出并发展建立起来一种 DNA 多态性分析

20、的新方 法 扩增片段长度多态性 (AFLP , 它可以用来检 测整个生物基因组的多态性 。AFLP 的基本原理是对基因组 DNA 酶切片 段进行选择性扩增 , 将获得的扩增片段通过琼脂 糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测, 根 据带型中一些特征条带的出现或消失, 检测出不 同扩增片段长度的多态性 。 一般而言, 首先使用 两种不同的限制性内切酶对整个基因组 DNA 进 行酶切反应, 然后将所得的两端具有不同黏性末 端的酶切片段与特异人工接头在 T4连接酶的作 用下进行连接, 形成选择性扩增的模板, 然后用 带有选择性碱基的特异引物进行选择性扩增 。 为 使得扩增效果更好, 反应一般分两步进

21、行, 即预 扩增和选择性扩增, 最后将获得的扩增产物通过 琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳, 再经 EB 染色或银染后, 清晰呈现片段长度的多态性 。 该技术建立初期用于植物育种的研究, 后来 发展成为可以分析任何来源 DNA 指纹图谱的一 项通用技术, 近些年来被广泛的应用于乳酸菌的 分类鉴定 。 2007年 Matteo Busconi 等 25首次应用 AFLP 技术对小牛肠道中的乳酸菌菌群进行了分 析, 他们选取了两只健康小牛肠道中的 311株乳 酸菌使用该技术完成了分类鉴定, 这些乳酸菌被 无一例外的分类到 8个属, 其中最具代表性的是 乳杆菌属 (169株 , 其次是链球菌属 (

22、99株 。 同 年, Zhechko Panayotov Dimitrov 等对 49株分离自 健康人类排泄物的乳酸菌进行了分类鉴定, 通过 对比使用 RAPD 、 PFGE 以及 AFLP 三种分子生物 学技术得出结论:RAPD 技术是最迅速最便捷的 技术, 但是重复性不好, 鉴定结果不甚准确; PFGE 技术虽然鉴定结果稳定且准确, 但是耗费人力物 力财力最大, 实施起来比较困难; 而 AFLP 技术操 作相对简单便捷, 而且鉴定结果准确, 完全可以在 种的水平上甚至于亚种的水平上对乳酸菌准确分 类鉴定,因此 AFLP 技术必将成为乳酸菌鉴定的强 有力的工具 。 2001年 Torrian

23、i 等 26使用 AFLP 技术 成功区分开了植物乳杆菌 (L. plantarum 、 戊糖乳杆 菌 (L. pentosus 和类植物乳杆菌 (L. paraplan -tarum 。 Ventura 采用 AFLP 技术, 不经过预扩增, 在其中一个预扩增引物加上一个选择性核苷酸 组成一对引物, 将 47株约氏乳杆菌 (L. johnsonii 为 7个亚类 。6DNA 探针技术及芯片技术DNA 探针技术是 20世纪 70年代在基因工 程学基础上发展起来的一项新技术, 又称核酸分 子杂交技术,具有敏感性高和特异性强等特点 。 91因为 DNA 探针技术方法特异 、 敏感又没有放射 性,且

24、不需要进行复杂的纯培养和扩培菌等过 程, 所以在微生物的鉴定方面应用前景广阔 。 DNA 探针技术的原理是:两条不同来源的核 酸链如果具有互补的碱基序列 , 就能够特异性的 结合而形成分子杂交链 。 若在已知的 DNA 或 RNA 片段上加上可识别的标记 (如用 32P 同位素 标记 、 生物素标记 , 就可制成 DNA 探针, 用以检 测未知样品中是否有与其互补的基因序列, 并可 进一步判定其与已知序列的相同程度 。 乳酸菌 DNA 探针技术是指利用限制性内切酶消化 DNA 后再用 DNA 探针来检测产生的 DNA 片段 。 Du Toit 利用 DNA 探针技术从 297株乳杆菌中成功 筛

25、选出了益生菌 。 2003年, Stackebrandt 等也应用 此项技术对采自当地酸牛乳中的 48株乳杆菌在 种的水平上成功进行了分类鉴定, 鉴定结果表明 干酪乳杆菌 (L. casei 是明显的优势菌群 。基因芯片是利用核酸杂交原理对未知分子 进行检测 。 将核酸或核酸片段按照一定顺序排列 在固相支持物上组成密集的分子阵列 。 按照其结 构基本上可分为两种类型:一种是将待测 DNA 分子样品固定在固相支持物上并与一系列游离 的标记探针杂交, 杂交探针或是单一的或是混合 的; 另一种是按照预先设定顺序将寡核苷酸固定 于固相支持物上,再与标记的 DNA 样品进行杂 交,然后由已知的寡核苷酸序

26、列确定被检测的 DNA 样品 。具体做法是将固相介质 (如玻璃片 通过适 当机制进行位置固定, 再利用高速机械手和连续 点样技术将多个 DNA 均匀地点在固相介质上, 为使点样精度保持恒定, 要求多针头具备单次取 样 、 连续点样的功能, 且自动取样的同时保证高 通量和高精度, 然后由系统直接通过程序控制连 续点样操作 。 信号的强弱由共聚焦的芯片检测器 测量 。 2006年, Bernard Berger 等人 27对 12株嗜酸 乳杆菌群 (L. acidophilus group 应用基因芯片技 术以及其他分子标记技术进行了分析研究, 结果 清晰阐释了这一嗜酸乳杆菌群之间的相似性和 细微

27、差异性 。7基因间重复序列分析技术1990年, Sharples 等在对 Escherichia coli tls 菌株基因组中 ds 的 3 末端区进行分析时首次发现 了 ERIC 片段, 命名为 “ 基因间重复单位 IRU(In -tergenic Repetitive Unit 序列 。 随后, Hulton 等也 鉴定出了相同的重复序列, 并命名为肠细菌基因 间保守重复序列 (Enterobacterial Repetitive Inter -genic Consensus , ERIC 。ERIC 的中心有一段保守性很高的反向重复 序列 , 该序列长约 44bp 。 Versalov

28、ic 等以 ERIC 的 核心序列设计了一对反向引物 (ERIC15 -ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3 , ERIC25 -AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3 , 认为 ERIC-PCR 扩增的是两个相邻的 ERIC 保守序列 之间的区域 , 由于不同的细菌基因组上的 ERIC 重 复序列的数目和分布不同, 从而得到由一系列大 小不同片段组成的 DNA 指纹图谱 。 此后, 这项技 术就被广泛用于细菌分类和菌种鉴别 。重复基因外回文序列分析技术 (Repetitive-Element PCR , REP-PCR 是以 PCR 为基础发

29、展起 来的一种针对原核生物的 DNA 指纹图谱技术 。 REP-PCR 技术的原理是利用特定的引物扩增细 菌基因组 DNA 的重复序列 , 这些序列在进化过 程中高度保守, 扩增位于这些序列之间的不同区 域可得到不同的图谱, 扩增产物经凝胶电泳便可 以分析其多态性 。 经实践研究证明该方法具有简 便快捷 、 重复性好 、 分辨率高等特点, 所以这项技 术也成为一种鉴定乳酸菌的新方法 。2001年, Francise Berthier 等对当地两个干酪 厂生产的八块干酪中的 488株嗜温乳杆菌运用 ERIC-PCR 技术进行了分类鉴定,其鉴定结果显 示,这 488株嗜温乳杆菌可以被分为 3个种群

30、, 其中副干酪乳杆菌 (L. paracasei 是超级优势菌 群, 占到了总数的 98.7%。 Ventura 等采用多种分 子标记方法对 16株约氏乳杆菌进行分类研究, 其中用 ERIC 标记分为 6个亚类, 用 REP-PCR 标 记则分为 4个亚类, AFLP 标记分为 7个亚类, ERIC 标记与 AFLP 标记比较有 90%-96%的相似 性,这也表明这些分子标记技术具有多重共线 性 。8展望分子生物学技术以其快速 、 准确 、 灵敏的优 点逐渐成为微生物分类鉴定的主要手段, 但是还 没有任何一种分子生物学技术可以单独用来鉴 定乳酸菌; 而传统的表型 、 生物化学方法鉴定乳 酸菌耗

31、时耗力, 鉴定结果不稳定, 只有将分子生 物学方法和传统鉴定方法结合起来鉴定乳酸菌 才会更加准确 。 不难想象, 随着技术手段的不断 改进 、 实验操做的逐步规范以及商品化试剂盒研 制进程的加快, 分子生物学技术必将在乳酸菌的 分类鉴定以及进一步研究中发挥更大的作用 。张家超等:适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术 92 乳业科学与技术 2009年第 2期 (总第 135期 参考文献1余勃 , 陆兆新 .AFLP 技术在食品微生物研究中的应用田 J.食品与发酵工业 , 2002,29(3 :75-78.2雷正瑜 .16S rRNA 序列分析技术在微生物分离鉴定中的应用 J.湖北生态技术学院学报

32、 , 2006,4(1 :4-7.3Parola P, Maurin M, Alimi Y, Juhan C, Brouqui P. Use of 16S rRNA gene sequencing to identify Lactobacillus casei in Septi -caemia Secondary to a Paraprosthetic Eenteric FistulaJ.Euro -pean Journal Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1998,17:203-205.4Booysen C, Dicks L M

33、T, Meijering I. Isolation identification and changes in the composition of lactic acid bacteria during the malting of two different barley cultivars J.International Journal of Food Microbiology, 2002,76:63-73.5乌日娜 , 张和平 , 孟和毕力格 . 酸马奶中乳杆菌 L. casei Zhang , ZL12-1的 16S rDNA 基因序列及聚类分析 J.中国乳 品工业 , 2005,3

34、3(6 :4-9.6Corsetti A, Lavermicocca P, Morea M. Pheno-typic and molecu -lar identification and clustering of lactic acid bacteria and yeasts from wheat (species Triticum durum and Triticumaes -tivum sourdoughs of Southern ItalyJ.International Journal of Food Microbiology, 2001,64:95-104.7Terence R, W

35、hitehead, Michael A, Cotta. Sequence analyses of a broad host-range plasmid containing ermT from a tylosin-re -sistant Lactobacillus sp. isolated from Swine Feces J.Urrent Microbiology, 2001,43:17-20.8Tilsaal -timisjarvi A, Alatossava T. Development of oligonu -cleotide primers from the 16S-23S rRNA

36、 intergenic sequences for identifying different dairy and probiotic lactic acid bacteria by PCR J.International Journal of Food Microbiology, 1997,35:49-56.9Isablel ópez, Carmen Torres, Fernanda, Ruia -larrea. Genetic typification by pulsed -field gel electrophoresis (PFGE and randomly amplifie

37、d polymorphic DNA (RAPD of wild Lacto -bacillus plantarum and Oenococcus oeni wine strainsJ.Euro -pean Food Research and Technology.10Ulrich Schillinger, Nuha M, Yousif K, Lilijana Sesar, Charles A, Franz P. Use of group -specific and RAPD -PCR analyses for rapid differentiation of Lactobacillus Str

38、ains from Probiotic yo -gurtsJ.Current Microbiology, 2003,47:453-456.11Spano G, Beneducel L, Depalma L, Quinto M, Vernilel A, Mas -sal S. Characterization of wine Lactobacillus plantarum by PCR -DGGE and RAPD -PCR analysis and identification of Lactobacillus plantarum strains able to degrade arginin

39、e J. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006,22: 769-773.12Williams G, Kubelik A R, Livak K J. DNA polymorphisms am -plified by arbitrary primers are useful as genetic markers J. Nucleic Acids Research, 1990,18(22 :6531-6535.13Muvzer G, Smalls K. Application of denaturing gradient gel

40、electrophoresis (DGGE and temperature gradient gel elec -trophoresis (TGGE in microhial ecology J.Antonie van Leeuwenhoek, 1998,73:127-141.14Muyzerg, Wallec, Uiitterlindenag. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysisof polymerase chain reaction-am

41、plified gens codingfor 16S rRNA J.Applied Environmental Microbiology, 1993,59:695-700. 15Milica Nikolic, Amarela Terzic -Vidojevic, Branko Jovcic, Natasa Golic, Ljubisa Topisirovic. Characterization of lactic acid bacteria isolated from Bukuljac, a homemade goat's milk cheese J.International Jou

42、rnal of Food Microbiology, 2008,122:162-170.16Spano G, Lonvaud-Funel A, Claisse O, Massa S. Invivo PCR-DGGE analysis of Lactobacillus plantarum and Oenococcus oeni populations in red wineJ.Current Microbiology, 2007,54: 9-13.17Kingsley C, Anukam, Emmanuel, Sazuwa O, Jeom A, Dgregor Reid. Assessment

43、of Lactobacillus species colonizing the vagina of apparently healthy Nigerian women, using PCR-DGGE and 16S rRNA gene sequencing J.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006,22:1055-1060.18Randazooc L, Torriani S, Akkermans A D L. Diversity dynamics and activity of bacterial communities p

44、roduction of an artisanal Sicilian cheese as evaluated by 16S rRNA analysisJ.Applied and Envrionmental Microbiology, 2002,68:1882-1892.19Hayford A E, Petersen A, Vogensen F K. Use of conserved ran -domly amplified polymorphic DNA (RAPD fragments and rapid pattern for characterization of Lactobacillus fermentum in ghanaian fermented maize doughJ.Applied and Environmen -tal Microbiology, 1999,65:3213-3221.20Elif Yavuz, Hatice Gunes, Cisem Bulut, Sebnem Harsa, Fazil A, Yenidunya. RFLP of 16S -ITS rDNA region to differentiate Lactobacilli at spe