第二十一单元--第七章微生物遗传学(三)

1、第一节 遗传变异的物质基础第二节 质粒第三节 基因突变的规律及类型1. 突变的定义2.基因突变的特点(规律)自发性不对应性独立性稀有性可诱变性稳定性可逆性3.证明基因突变自发性和不对应性的实验证据4.基因突变的类型第四节 基因突变的机制1.基因突变的分子基础自发突变诱发突变(化学诱变/物理诱变/生物诱变)2.诱变及化学致癌物质的检测Ames实验3.DNA损伤的修复第五节 微生物的诱变育种一、诱变育种中的几个原则一、诱变育种中的几个原则 指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。率

2、显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。2个主要环节：个主要环节：诱变（随机）诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。提高。筛选（定向）筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。优良菌株挑选出来。（一）（一） 出发菌株（出发菌株（original strain）出发菌株出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。指用于诱变育种的起

3、始菌株。 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）；标记明显等）； 对诱变剂敏感对诱变剂敏感野生型菌株；野生型菌株；从生产中选育的自发突变菌株；从生产中选育的自发突变菌株；诱变获得的高产菌株诱变获得的高产菌株出发菌株的选择标准：出发菌株的选择标准：出发菌株的来源：出发菌株的来源：（二）（二） 菌悬液的制备菌悬液的制备1. 选用单细胞或单孢子悬液选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）（均匀、分散）目的：目的：使每个细胞能均匀接触诱变剂；使每个细胞能均匀接触诱变剂； 减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）减少表型延迟现象（

4、诱变后性状的分离及退化现象）2. 同步培养同步培养（生理状态一致）（生理状态一致）3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期孢子或芽孢：萌发前期4.4.菌悬液的制备方法菌悬液的制备方法 物理诱变：生理盐水配制物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制化学诱变：缓冲液配制5. 菌悬液的浓度菌悬液的浓度 酵母菌，霉菌的孢子：酵母菌，霉菌的孢子：10106 6个个/ /mLmL 细菌，放线菌孢子：细菌，放线菌孢子：10108 8个个/ /mLmL （三）诱变剂的选择及处理方法（三）诱变剂的选择及处理方法1. 诱变剂的选择（诱变剂的

5、选择（高效，简便高效，简便） 物理诱变剂：物理诱变剂：频度低，大损伤，难修复，且操作简便；频度低，大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG超诱变剂）超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂是最常用的一种诱变剂2. 剂量的选择剂量的选择 突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量高剂量, 反而会使突变率下降。反而会使突变率下降。 正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。量中。 在产

6、量变异工作中，常采用相对杀菌率为在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为7075%, 甚至甚至3070%的剂量的剂量。 UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。最适剂量：最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。又能使变异向正突变范围移动的剂量。常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）3. 诱变处理方法诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理：单因素处理或多因素的复合处理：同一诱变剂的重复使用；同一诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱

7、变剂的同时使用两种或多种诱变剂的同时使用. .（四）（四） 中间培养（中间培养（CM，培养过夜）培养过夜）目的：目的：克服表型延迟克服表型延迟表型延迟表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的表型的改变落后于基因型改变的 现象现象. 分离性延迟：分离性延迟： 突变的基因经突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯复制和细胞分裂后变成纯 合状态，表型才能表现出来合状态，表型才能表现出来。 生理性延迟：生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 表现出来。表现出来。分离性延迟的原因分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常

8、出现双核对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。象称为分离延迟现象。生理性延迟的原因生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时时, ,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用, ,

9、必必须经过细胞多代分离后须经过细胞多代分离后, ,才能将这些非变异的酶稀释掉才能将这些非变异的酶稀释掉, ,最终最终达到变异后应该表现的形态达到变异后应该表现的形态, ,如营养缺陷型突变株的筛选过如营养缺陷型突变株的筛选过程。程。 生理性延迟生理性延迟:（五）突变株的筛选（五）突变株的筛选 初筛初筛 复筛复筛1. 初筛（以量为主）初筛（以量为主）（1 1）利用形态变异：）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性需预先测定形态与产量的相关性（2 2）根据平板颜色反应直接挑选）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素

10、）；抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素）沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（透明圈直径（H H）/ /菌落直径（菌落直径（C C）：）：产量高低（初筛指标）产量高低（初筛指标）2. 复筛（以质为主，定量测定）复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养，直接检测所需产物摇瓶培养，直接检测所需产物方法需简便、快速2步步诱变育种的基本原则：诱变育种的基本原则： 选择简便有效的诱变剂；选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的出发菌株；挑选优良的出发菌株； 处理单细胞或单孢子悬液；处理单细胞或单孢子悬液； 选用最适的诱变剂量；选用最适的诱变剂

11、量； 充分利用复合处理的协同效应；充分利用复合处理的协同效应； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 设计高效筛选方案；设计高效筛选方案； 创造新型筛选方法。创造新型筛选方法。二、几种重要突变株的筛选方法二、几种重要突变株的筛选方法 1. 抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选 (1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选抗终代谢物结构类似物突变株的筛选 (2) 抗药性突变株筛选抗药性突变株筛选 2. 营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选 1. 抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选 （1）抗终代谢物结构类似物的突变株）抗终代谢物结构类似物的突变株 用途：筛选相应代谢物

12、的高产菌株用途：筛选相应代谢物的高产菌株 （2）抗药性突变株）抗药性突变株 用途：筛选相应药物用途：筛选相应药物(抗生素抗生素) 的高产菌株或遗传标记制作的高产菌株或遗传标记制作 筛选的方法筛选的方法: a. 高于临界浓度的平板进行分离； b. 梯度平板法 敏感敏感菌苔菌苔 抗性抗性菌落菌落加入含异烟肼的上层加入含异烟肼的上层 加入不含异烟肼的底层加入不含异烟肼的底层 所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。 如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。

13、为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?2. 营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选（1）几个概念：）几个概念：三类培养基：三类培养基：基本培养基（基本培养基（MM, minimal mediumMM, minimal medium）-：某野生型能生长的最低成分的组合培养基。某野生型能生长的最低成分的组合培养基。完全培养基（完全培养基（CM,complete mediumCM,complete medium）+：各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基补充培养基（补充培养基（SM, supplemental mediumSM

14、, supplemental medium）A:-+AA:-+A B:-+B B:-+B相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基三种遗传型：三种遗传型：野生型（野生型（wild typewild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。 A A+ +B B+ +, 可在可在-生长。生长。营养缺陷型（营养缺陷型（auxotrophauxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成

15、产物的培养基中才能生长的力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。 A A+ +B B- - ：能在能在+、 BB生长生长 A A- -B B+ + ：能在能在+、 AA生长生长 A A- -B B- - ：能在能在+生长生长原养型（原养型（prototrophprototroph） 营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求 A A+ +B B+ +, 可在可在-生长生长（2）筛选步骤（）筛选步骤（5步）步）

16、诱变处理诱变处理中间培养中间培养淘汰野生型淘汰野生型检出缺陷型检出缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型中间培养中间培养CMCM或或SMSM培养基培养基，培养过夜培养过夜。克服表型延迟。克服表型延迟。淘汰野生型淘汰野生型即浓缩缺陷型，以提高检出率即浓缩缺陷型，以提高检出率方法方法 抗生素法抗生素法（G G+ +细菌细菌：青霉素；青霉素；酵母菌和霉菌：酵母菌和霉菌：制霉菌素）制霉菌素） 菌丝过滤法菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）（丝状真菌、放线菌） 饥饿培养（无饥饿培养（无N N）MM 6 612 h12 h 2N 2N培养培养(2(2N)MMN)MM 1 12 h2 h 加抗生素加抗生素( (或菌丝过滤或菌

17、丝过滤) )，培养过夜，培养过夜 营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出方法夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法 营养缺陷型的鉴定营养缺陷型的鉴定生长谱法：生长谱法：快速，直观快速，直观分两步：分两步：a.a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定b.b.具体到某一种营养要求的鉴定具体到某一种营养要求的鉴定( (哪一种氨基酸哪一种氨基酸, ,哪一种哪一种 维生素维生素, ,或哪一种碱基或哪一种碱基) )具体操作具体操作: :一般采用一般采用“滤纸片法滤纸片法” a. 不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液或蛋白胨 b. 水溶性维生素混合液

18、c. 0.1%碱水解酵母核酸液a b c三大类营养要求的鉴定：三大类营养要求的鉴定：以氨基酸缺陷为例进行说明以氨基酸缺陷为例进行说明将将1818种氨基酸按右表分为种氨基酸按右表分为6 6组组特点：特点：每每2 2组只有一种共同物质组只有一种共同物质单一营养物质要求的鉴定：单一营养物质要求的鉴定：组组别别化合物代号化合物代号115678922510111213336101415164471114171858121517691316181 3 52 4 6（3）营养缺陷型的用途）营养缺陷型的用途 生产菌 (氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)； 研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。 诱变

19、育种的程序：实验讲义诱变育种的程序：实验讲义p174 出发菌株出发菌株（纯化）（纯化） 前培养前培养（ CM ，培养至对数期），培养至对数期） 菌悬液制备菌悬液制备 活菌计数活菌计数 诱变预备实验（剂量存活率曲线）诱变预备实验（剂量存活率曲线） 诱变处理诱变处理（相对杀菌率为（相对杀菌率为70-75%，30-70%） 活菌计数活菌计数 中间培养中间培养（CM，培养过夜，克服表型延迟）培养过夜，克服表型延迟） 突变株分离突变株分离 初筛初筛 复筛复筛 生产性能试验生产性能试验 菌种（鉴定与）保藏菌种（鉴定与）保藏 1. 从生产中选育从生产中选育 2. 定向培育优良品种定向培育优良品种 一般指用特

20、定因素长期处理微生物群体，同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。 例：卡介苗（牛型结核分枝杆菌的减毒活菌苗）三、自发突变与育种三、自发突变与育种第六节第六节 原核生物的基因重组原核生物的基因重组基因重组基因重组（gene recombination）： 将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称为基因重组(gene recombination)或遗传重组。 重组重组：遗传物质在分子水平分子水平上发生的交换；杂交杂交：在细胞水平细胞水平上遗传物质的交换. 杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。原核生物的基

21、因重组类型原核生物的基因重组类型 4种形式：种形式：1）转化）转化 2）转导）转导 3）接合）接合 4）原生质体融合）原生质体融合一、一、 转化（转化（transformation）定义定义：受体细胞直接吸收供体细胞的受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段片段, 并与其染色体并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。状的现象。 转化子（转化子（ transformant）：经转化后出现了供体性状的受体细经转化后出现了供体性状的受体细胞称为胞称为转化子转化子，即转化成功的菌落。即转化成功的菌落。 目前已知有二十

22、多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。自然遗传转化（自然遗传转化（natural genetic transformation）人工转化（人工转化（artificial transformation）感受态细胞（competent cell） ：具有摄取外源具有摄取外源DNA能力的细胞能力的细胞1. 感受态感受态感受态：是指受体细胞最易接受外源感受态：是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化片段并能实现转化的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决定的，但受环

23、境条件的影响也很大，因而表现差别很大。定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别很大。 感受态因子：感受态因子：调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要成分：膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。 自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性 （如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期） 受细菌自身的基因控制人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有 摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！该过程与细菌自身的遗传控制无关！）进行自然转化，需要二方面必要的条件：（1）建立了感受态的受体

24、细胞感受态的受体细胞（2）外源游离）外源游离DNA分子分子感受态的机理研究：感受态的机理研究：局部原生质体化假说：局部原生质体化假说：处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经膜能顺利经膜进入菌体。进入菌体。酶受体假说：酶受体假说：受体细胞表面出现了一种能结合受体细胞表面出现了一种能结合DNA并使之进入细胞的酶。并使之进入细胞的酶。2. 转化模型转化模型 （1）转化因子）转化因子 本质是离体的本质是离体的DNA片断或质粒片断或质粒DNA DNA 。转化因子进入细胞前。转化因子进入细胞前还会被酶解成更小的片段，约还会被酶解成更小的片段，约8kb

25、。在不同的微生物中，转化因在不同的微生物中，转化因子的形式不同，子的形式不同，dsDNA,ssDNA.dsDNA,ssDNA. 革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收dsDNAdsDNA形式的转化因形式的转化因子，但进入细胞后需经酶解为子，但进入细胞后需经酶解为ssDNAssDNA，才能与受体菌的基因组整，才能与受体菌的基因组整合；合； 革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中，革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中，dsDNAdsDNA的一条链必须在的一条链必须在胞外降解，只有胞外降解，只有ssDNAssDNA形式的转化因子才能进入细胞。形式的转化因子才能进入细胞。 但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNAdsDNA。 由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺炎链球菌约炎链球菌约1010个），因此，从外界加入无关的个），因此，从外界加入无关的dsDNAdsDNA就可竞争并就可竞争并干扰转化作用。干扰转化作用。 质粒质粒DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染色体组发生重组。色体组发生重组。 转化的频率通常为转化的频率通常