克隆实验的目的研究分子生物学知识 生产生物分子 设计构建新物

1、克隆实验的目的： 研究分子生物学知识 生产生物分子 设计构建新物种7.1 Vectors for yeast and other fungiThe yeast 2m plasmid. REP1 and REP2 are involved in replication of the plasmid, and FLP codes for a protein that can convert the A form of the plasmid (shown here) to the B form, in which the gene order has been rearranged by intr

2、amolecular recombination. The function of D is not exactly known.7.1.1 Selectable markers for the 2m plasmid筛选标记问题筛选标记问题7.1.2 Vectors based on the 2m plasmid-yeast episomal plasmids酵母游离型质粒酵母游离型质粒(yeast episomal plasmid,YEp)穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)：能够在多种：能够在多种生物体内进行复制的生物体内进行复制的载体分子。载体分子。P3127.1.2 Vec

3、tors based on the 2m plasmid-yeast episomal plasmids7.1.3 A YEp may insert into yeast chromosomal DNA 7.1.4 Other types of yeast cloning vector酵母整合型质粒酵母整合型质粒(yeast integrative plasmid,YIp)：细菌质粒加酵母基因：细菌质粒加酵母基因构建的。构建的。URA3编码乳清酸核苷编码乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶磷酸脱羧酶，该酶参与嘧啶核苷酸生物合成。，该酶参与嘧啶核苷酸生物合成。酵母复制型质粒酵母复制型质粒(yeast re

4、plicative plasmid,YRp)：含复制起点的酵母：含复制起点的酵母染色体染色体DNA序列。序列。YRp7由由pBR322质粒加酵母基因质粒加酵母基因TRP1构成。该基因与色氨酸生物合构成。该基因与色氨酸生物合成有关。成有关。7.1.4 Other types of yeast cloning vector1.转化频率转化频率(transformation frenquency)： YEpYRpYIp如何选用酵母载体2.拷贝数拷贝数(copy number)： YEp和和YRpYIp3.稳定性稳定性(stability)： YIp YRp和和 YEp7.1.5 Artificial

5、 chromosomes can be used to clone large pieces of DNA in yeast 染色体的必需组分：着丝粒、两个端粒和复制起点染色体的必需组分：着丝粒、两个端粒和复制起点YAC载体的结构和用途载体的结构和用途复制起点：复制起点：TRP1着丝粒序列：着丝粒序列：CEN4端粒：端粒：TEL外源基因插入位点：外源基因插入位点：SUP4（形成红色菌落（形成红色菌落，如失活则形成白色菌，如失活则形成白色菌落）落）7.1.6 Vectors for other yeasts and fungiYAC载体的应用载体的应用 优点：操作长度可达优点：操作长度可达600

6、1400kb。不足：插入稳定性不好，分子内重组。不足：插入稳定性不好，分子内重组。7.2.1 Agrobacteriurn tumefaciens - natures smallest genetic engineer7.2 Cloning vectors for higher plants7.2.1 Agrobacteriurn tumefaciens - natures smallest genetic engineerTi质粒载体的构建质粒载体的构建双载体策略：构建一个双质粒系双载体策略：构建一个双质粒系统，一个是除去统，一个是除去T-DNA的的Ti质粒质粒A，另一个是与，另一个是与T-

7、DNA相连的相相连的相对较小的质粒对较小的质粒B，A携带的基因编携带的基因编码的蛋白质让码的蛋白质让B携带的携带的 T-DNA转转入植物染色体入植物染色体DNA上。上。共整合策略：改造共整合策略：改造pBR322或其或其它类似大肠杆菌质粒，让它们它类似大肠杆菌质粒，让它们携带携带T-DNA的一小部分。由于的一小部分。由于新构建的质粒与新构建的质粒与Ti质粒有同源质粒有同源序列，当它们共存于同一个根序列，当它们共存于同一个根瘤农杆菌内时，会发生同源重瘤农杆菌内时，会发生同源重组，使得组，使得pBR质粒整合进质粒整合进Ti质质粒粒T-DNA区域。如将外源目的区域。如将外源目的基因插入基因插入pBR

8、质粒，再用该农质粒，再用该农杆菌感染植物，新基因就和杆菌感染植物，新基因就和T-DNA一起被整合到植物染色体一起被整合到植物染色体上了。上了。获得获得Ti质粒转化质粒转化的植株的植株Ri 质质 粒粒 用农杆菌质粒克隆的局限性用农杆菌质粒克隆的局限性 Ri质粒是适合用于表达植物蛋白的载体质粒是适合用于表达植物蛋白的载体7.2.2 Cloning genes in plants by direct gene transfer直接将基因转入细胞核中直接将基因转入细胞核中将基因转入叶绿体基因组中将基因转入叶绿体基因组中在工程植物中用于在工程植物中用于蛋白的生产蛋白的生产右上图:Direct gene

9、transfer右下图: Direct gene transfer by precipitation of DNA onto the surfaces of protoplasts7.2.3 Attempts to use plant viruses as cloning vectorscaulimovirus载体载体1984年人们用caulimovirus载体把一个新基因转入胡萝卜中。不足不足能够插入DNA的大小非常有限；宿主范围太窄。geminivirus载体载体优点：宿主是玉米和小麦；不足：会发生基因重排和删除，目前已解决，正在应用。7.3.1 Cloning vectors for i

10、nsects7.3 Cloning vectors for animals用用P元件作果蝇的克隆载体元件作果蝇的克隆载体转座子转座子(transposon)：能够在基因组内从一个地方转移到另一个：能够在基因组内从一个地方转移到另一个地方的地方的DNA序列。序列。P313P元件元件：是果蝇中的转座子之一，长：是果蝇中的转座子之一，长2.9kb，包含，包含3个基因，在个基因，在P 元件两端各含有一小段反向重复序列。转座酶由这元件两端各含有一小段反向重复序列。转座酶由这3个基因编码个基因编码，能识别转座子两端的反向重复序列，并执行转座功能。，能识别转座子两端的反向重复序列，并执行转座功能。P元件不仅

11、能从同一条染色体的一个位置转移到另一个位置，还能跨元件不仅能从同一条染色体的一个位置转移到另一个位置，还能跨染色体移动，并能从含有染色体移动，并能从含有P元件的质粒移动到果蝇的一条染色体上。元件的质粒移动到果蝇的一条染色体上。克隆载体被设计成含有两个克隆载体被设计成含有两个P元件。其中一个元件。其中一个P元件有可插入被克隆基因的元件有可插入被克隆基因的酶切为点，当外源基因插入后，转座酶的编码序列被破坏了，因此这个酶切为点，当外源基因插入后，转座酶的编码序列被破坏了，因此这个P元件是无活性的；相应的该质粒中的另一个元件是无活性的；相应的该质粒中的另一个P元件所携带的转座酶是完整元件所携带的转座酶

12、是完整的，但它两端的反向重复序列被去掉了，因此该的，但它两端的反向重复序列被去掉了，因此该P元件不会被转座到果蝇元件不会被转座到果蝇染色体上。当被克隆的外源基因被插入到载体上后，质粒染色体上。当被克隆的外源基因被插入到载体上后，质粒DNA被显微注射被显微注射进果蝇的胚胎中去。后一个进果蝇的胚胎中去。后一个P元件上的转座酶基因编码的转座酶将带有外元件上的转座酶基因编码的转座酶将带有外源基因的源基因的P元件转到染色体上。若这一过程发生在生殖种系细胞的细胞核元件转到染色体上。若这一过程发生在生殖种系细胞的细胞核中，那么由这个胚胎发育来的成年果蝇在它的所有细胞中均含有这个新基中，那么由这个胚胎发育来的

13、成年果蝇在它的所有细胞中均含有这个新基因。因。基于昆虫病毒的克隆载体基于昆虫病毒的克隆载体杆状病毒杆状病毒(baculovirus)：在昆虫中普遍存在，不会感染脊椎动物，该：在昆虫中普遍存在，不会感染脊椎动物，该病毒基因组中含有多角体蛋白基因，该基因在昆虫细胞中聚集，以核病毒基因组中含有多角体蛋白基因，该基因在昆虫细胞中聚集，以核包涵体形式存在，该基因产物常占细胞蛋白总量包涵体形式存在，该基因产物常占细胞蛋白总量50%以上，故以上，故主要用主要用途是生产重组蛋白。途是生产重组蛋白。7.3.2 Cloning in mammals 哺乳动物克隆基因的目的： 基因敲除 生产重组蛋白质 基因治疗基因

14、敲除（gene knockout）：一种使某个基因失活的技术。P306哺乳动物的克隆载体哺乳动物的克隆载体第一次哺乳动物克隆实验是在第一次哺乳动物克隆实验是在1979年进行的。用的载体是年进行的。用的载体是SV40，该基因组长，该基因组长5.2kb ，包含，包含两套基因：早期基因两套基因：早期基因(编码与病编码与病毒复制有关的蛋白毒复制有关的蛋白)、晚期基因、晚期基因(编码外壳蛋白质编码外壳蛋白质)。腺病毒：腺病毒：8kb，操作有难度；，操作有难度；乳头状瘤病毒：乳头状瘤病毒：8kb，可获得稳，可获得稳定细胞系；定细胞系；腺伴随病毒：腺伴随病毒：利用腺病毒合成利用腺病毒合成蛋白质进行自身复制，总是插蛋白质进行自身复制，总是插入人类入人类19号染色体；号染色体；反转录病毒：反转录病毒：插入随机，插入插入随机，插入后稳定。后稳定。牛乳头状瘤病毒：牛乳头状瘤病毒：导致牛长出导致牛长出疣，在小鼠中以多拷贝存在不疣，在小鼠中以多拷贝存在不导致宿主细胞死亡。被设计成导致宿主细胞死亡。被设计成穿梭载体生产重组蛋白质。穿梭载体生产重组蛋白质。不使用载体的基因克隆技术不使用载体的基因克隆技术 病毒载体没能在哺乳动物基因克隆领域广泛应用，一个重