实验三_单向琼脂扩散实验

1、临床免疫学实验指导临床免疫学实验指导 检验医学院检验医学院 免疫学教研室免疫学教研室吴荣泉吴荣泉1303609532613036095326 实验二、实验二、 单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验【实验原理实验原理】 将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，打孔，在孔中将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，打孔，在孔中加入待测抗原，抗原可向四周呈辐射状扩散，当抗原，抗体在加入待测抗原，抗原可向四周呈辐射状扩散，当抗原，抗体在比例适宜时形成白色沉淀环比例适宜时形成白色沉淀环. 沉淀环直径与抗原含量成正比沉淀环直径与抗原含量成正比。用标准抗血清和已知浓度的抗原（或国际参考品）制成标准用标准抗血清和已知浓

2、度的抗原（或国际参考品）制成标准曲线。通过测定样品沉淀环直径大小，可从标准曲线中读出抗曲线。通过测定样品沉淀环直径大小，可从标准曲线中读出抗原的含量。原的含量。本试验主要用于检测标本中各种本试验主要用于检测标本中各种Ig、补体的含量等，具有高灵、补体的含量等，具有高灵敏性，高特异性特点。敏性，高特异性特点。 【实验目的与要求实验目的与要求】 掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、 结果分析及临床应用结果分析及临床应用 【试剂与器材试剂与器材】 1. 1. 羊抗人羊抗人IgGIgG血清（兔抗人血清，购买）血清（兔抗人血清，购买） 2. 2. 标准参考血清标准

3、参考血清( (标准标准IgGIgG质控物，购买质控物，购买) ) 3. 3. 待检人血清（待检人血清（IgGIgG抗原）抗原） 4. pH7.4 0.01M PBS 4. pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或缓冲液（或NSNS） 5. 5. 琼脂粉（制备琼脂粉（制备1%1%免疫盐水琼脂液）免疫盐水琼脂液） 6. 6. 载玻片、打孔器、载玻片、打孔器、 3737恒温箱、湿盒、恒温箱、湿盒、 可调微量加样器等可调微量加样器等用于制作用于制作标准曲线标准曲线【操作注意事项操作注意事项】1. 1. 制备抗体琼脂板制备抗体琼脂板 琼脂温度必须严格控制，温度琼脂温度必须严格控制，温度 太低琼脂会凝固，

4、太高则会影响抗体的活性太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性2. 2. 加样孔内的琼脂应挑干净加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边，切不可损坏孔的边 缘，确保每孔的液面基本一致缘，确保每孔的液面基本一致3. 3. 加样精确加样精确，不能逸出孔外，否则结果不好观察，不能逸出孔外，否则结果不好观察4. 4. 加样加样吸取不同每份标本均应更换塑料吸头吸取不同每份标本均应更换塑料吸头5. 5. 检测过程中，标准曲线必须与样品同步操作检测过程中，标准曲线必须与样品同步操作6. 6. 孵育时间应控制在孵育时间应控制在3737，24-4824-48小时，小时，时间太短时间太短 或时间太长会影响沉淀线的形

5、成和清晰度。或时间太长会影响沉淀线的形成和清晰度。 【标准曲线的制备标准曲线的制备】由实验教师由实验教师 1. 1. 购买标准已知浓度的购买标准已知浓度的 人血清（人血清（IgGIgG抗原）抗原） 购买标准羊抗人（兔抗人）购买标准羊抗人（兔抗人） 抗人抗人IgG-IgG-抗体（抗血清）抗体（抗血清） 2. 2. 制备制备1%1%盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记）盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记） 取琼脂粉取琼脂粉1.0g1.0g，加，加NSNS，100ml.100ml.混匀加热溶解成透明液体，混匀加热溶解成透明液体， 放放5656，加入标准抗血清，加入标准抗血清1.01.01.5m

6、l1.5ml，混匀，制板，混匀，制板 3. 3. 制板，打孔，孔径制板，打孔，孔径3mm3mm，孔距，孔距1.2-1.5cm1.2-1.5cm，打，打5 5个孔。个孔。 4. 4. 加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10L10L 110110， 120120， 140140，180180， 1 :160.1 :160. 稀释稀释 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg ，6.25mg. 6.25mg. 浓度浓度 5. 5. 保温反应：将凝胶板放湿盒内，保温反应：将凝

7、胶板放湿盒内，3737反应反应24h,24h,观察结果观察结果. . 6. 6. 用坐标纸制作标准曲线用坐标纸制作标准曲线: :以沉淀环直径以沉淀环直径（m mm m）为纵坐标为纵坐标; ; 以标准浓度的对数值（以标准浓度的对数值（LgLg）为横坐标绘制标准曲线）为横坐标绘制标准曲线. .标准曲线与样品测定结果（实物实拍）标准曲线与样品测定结果（实物实拍） 测定样本：测定样本： 病人血清（病人血清（ 标本标本 1. 25mm， 标本标本 2. 20mm ） 标准曲线制备：标准抗原稀释标准曲线制备：标准抗原稀释4 4钟浓度，预温钟浓度，预温24h24h，沉淀环直径数据，沉淀环直径数据 30 m

8、m 30 m m 25 m m 25 m m 20 m m 20 m m 15 m m 15 m m 以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg） 为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。 沉沉 淀淀 环环 直直 径（毫米）径（毫米） 4256738 标准抗原稀释：标准抗原稀释： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160 相当抗原浓度：相当抗原浓度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L 沉淀环直径：沉淀环直径： 7mm 6

9、mm 5mm 4mm 3mm Lg值：值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9 【实验方法实验方法】 1. 制备制备1.0%免疫盐水琼脂液免疫盐水琼脂液 取琼脂粉取琼脂粉1.0g ，加入，加入100ml. NS，混匀加热溶解。，混匀加热溶解。 加热时用玻棒不断轻轻搅拌，使成透明液体，放加热时用玻棒不断轻轻搅拌，使成透明液体，放56， 加入加入 1 : 2 稀释的羊（兔）抗人血清稀释的羊（兔）抗人血清1.25ml，混匀，混匀， 56保温备用。保温备用。 2. 制板：制板： 每每2人制作人制作1个凝胶板。个凝胶板。 取清洁玻片

10、一张，在背面一角处标记，用取清洁玻片一张，在背面一角处标记，用5ml或或10ml 刻度吸管刻度吸管 ，每片缓慢滴加，每片缓慢滴加3.5 - 4.0ml琼脂液，待凝。琼脂液，待凝。 3. 打孔：打孔： 每玻片打孔两个，孔径每玻片打孔两个，孔径3mm，孔距，孔距1.0-1.2cm， 用竹签尖将孔内琼脂挑出。用竹签尖将孔内琼脂挑出。 4. 加样：加样： 用用NS将血清稀释）将血清稀释）10l血清血清+190l,NS= 1:20 混匀混匀3次，吸出次，吸出10l + 10l NS= 1;40 向琼脂孔内分别加入向琼脂孔内分别加入:20:20， 1 : 401 : 40 稀释血清各稀释血清各10l 5.

11、 保温反应：将琼脂板放湿盒内，保温反应：将琼脂板放湿盒内，37温育温育24-48h。 6. 测量沉淀环最大直径，查标准曲线。测量沉淀环最大直径，查标准曲线。 计算：计算：血清血清 IgG (mg/L) =对应的血清对应的血清IgG含量含量（稀释倍数）（稀释倍数） 以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg） 为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。 沉沉 淀淀 环环 直直 径（毫米）径（毫米） 4256738 标准抗原稀释：标准抗原稀释： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40，

12、 1 ：80 ， 1 ：160 相当抗原浓度：相当抗原浓度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L 沉淀环直径：沉淀环直径： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mm Lg值：值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9AgAgAgAg【结果计算结果计算】n分别量取各孔样品沉淀环的直径，在标准分别量取各孔样品沉淀环的直径，在标准曲线上查出对应的曲线上查出对应的IgGIgG含量。含量。n待测血清待测血清IgGIgG含量含量(mg/L)(mg/L) IgG mg/L = IgG mg/L = 标准曲线对应结果标准曲线对应结果4 4（稀释倍数）（稀释倍数）n参考值参考值: : 成人血清成人血清 IgG:IgG: 700-1660