分子医学技能：实验二 PCR检测乙肝病毒-PCR分析apoB基因多态性

1、 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增特异是一种体外扩增特异DNA片断的技术片断的技术,能在短时间内获得能在短时间内获得数百万个特异数百万个特异DNA序列的拷贝。序列的拷贝。 特异性特异性、高效性高效性PCRPCR技术的创建技术的创建一、最初的理论描述一、最初的理论描述KhoranaKhorana Khorana (1971)Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设等最早提出核酸体外扩增的设想：想：“经经DNADNA变性，与合适的引物杂交，用变性，与合适的引物杂交，用DNADNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可

2、合成聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNAtRNA基因。基因。” 但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定定DNADNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。所以，这种想法似乎没有实际意义。所以，KhoranaKhorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了PCRPCR技术的创建技术的创建二、二、PCRPCR技术的发明技术的发明Kary B. MullisKary B. Mullis 19851985年，年，Kary MullisKary Mullis在在CetusCetus公司工作期

3、公司工作期间，发明了间，发明了PCRPCR MullisMullis要合成要合成DNADNA引物来进行测序工作，却引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板常为没有足够多的模板DNADNA而烦恼而烦恼 19831983年年4 4月的一个星期五晚上，他开车去乡月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上下别墅的路上The Nobel Prize in Chemistry 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method（1/2 of the prize ） PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况

4、下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程包括若干个循环，每个循环包括三步： 变性：加热，模板DNA形成两条单链 退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合 延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下， 引物3-端向前延伸，合成与模板配对的新链Step 1. DenaturationStep 1. Denaturation（变性）（变性）Temperature: 95 degrees Celsius lThe reaction is first heated to denature (separate) the sides of the double- stranded DNA Step

5、2. AnnealStep 2. Anneal（退火）（退火）lthen cooled to allow the primers to find and bind to their complementary sequences on the separated strands.Step 3. ExtendStep 3. Extend（延伸）（延伸）lthe polymerase to extend the primers into new complementary strands.Repeat the CyclesRepeat the CycleslRepeated heating and

6、 cooling cycles multiply the target DNA exponentially, since each new double strand separates to become two templates for further synthesis. . 1个循环后的结果个循环后的结果第第2个循环后的结果个循环后的结果模版模版第第1次的产物次的产物第第2次的产物次的产物AABBCD第第3个循环后的结果个循环后的结果第第3次的产物次的产物第第4个循环后的结果个循环后的结果第第4次的产物次的产物1A，1B，2C，2D，2EAB2C2D2E1A，1B，3C，3D，6（2

7、2+2）EAB3C3D6E第第N个循环后的结果个循环后的结果第第N次的产物次的产物1A，1B，（N-1）C，（N-1）D，(2n-2+2) E(2n-2+2) EABN-1CN-1DPCRPCR反应体系的组成及功能反应体系的组成及功能PCR的完成是在一个0.2或0.5ml的EP管中完成，一个完整的PCR反应体系应包括以下成分： 引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素; PCR引物设计的原则；目的是提高扩增的效率与特异性。 终浓度为0.10.5umol/L Taq DNA聚合酶 有良好的热稳定性，具有5-3聚合酶活性。高保真Taq酶具有3-5核酸外切酶的活性，PCR

8、扩增过程中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。 其活性对Mg2+浓度非常敏感 终浓度一般为：2.5u/100ul 最适温度一般为72 模板DNA 相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。 模板用量也是很低的，一般认为102104拷贝模板就可以满足要求。 dNTP Mix (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)： 已有商品化的混合液，终浓度一般为20200umol/L dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量y10PCR反应buffer： 已作成商品化的产品

9、，它包括： 250500mmol/L KCl； 100500mmol/LTris-HAC（pH8.4）； 1520mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5 2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）； 0.1%明胶或牛血清白蛋白（稳定酶活性） dd H2O 调节反应体积 液体石蜡油 （减少PCR过程中，尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失） 一般一般PCRPCR实验设计实验设计样品反应 不同的退火温度梯度 不同的Mg2浓度 不同的模板浓度阴性对照反应阳性对照反应PCRPCR技术的特点技术的特点l灵敏度高灵敏度高1.1.3030轮循环轮循环, ,扩

10、增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）2.2.将模板从皮克将模板从皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6-6) )水平水平3.3.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞4.4.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个PFUPFU5.5.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌l特异性强特异性强 引物序列与模板结合的特异性引物序列与模板结合的特异性l快速简便快速简便 一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4小时即可完成扩增小时即可完

11、成扩增 生物学基础研究目的基因扩增和鉴定 、DNA测序、定点突变 医学临床应用遗传疾病基因诊断、致病病原体检测 、组织配型 人类基因组工程遗传图谱的构建、DNA测序、表达图谱 法医学物证鉴定个体识别、亲子鉴定 其他 动植物检疫、系统进化研究、分子考古学HBVHBV检测试剂盒介绍检测试剂盒介绍构成： DNA提取液 检测反应管（PCR反应体系，上样buffer，石蜡油） 阳性模板设计： 反应管中有针对HBV的特异性引物，若出现与阳性对照相同的结果，则说明待测样品中含有HBV1 1、待测血清中、待测血清中DNADNA简单制备简单制备上清上清3 3、PCRPCR反应程序反应程序实验目的及预期结果实验目的及预期结果l目的：目的：p检测来自不同样本的基因多样性检测来自不同样本的基因多样性l检测技术：检测技术：apoB基因的基因的PCRl预期结果：预期结果：p琼脂糖电泳条带的差异琼脂糖电泳条带的差异apoBapoB多态性分析的基本实验过程多态性分析的基本实验过程来源不同的待测样本来源不同的待测样本PCRPCR扩增目的基