分子医学技能实验4质粒DNA的制备

1、分子医学技能分子医学技能实验四实验四本周本周下周下周质粒质粒DNA的制备的制备存在于存在于细菌体细菌体内的一类独立于染色体的内的一类独立于染色体的自主复制自主复制的遗传成分，在细胞内它们常的遗传成分，在细胞内它们常以以共价闭环共价闭环的超螺旋形式存在。的超螺旋形式存在。1.抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)2.启始复制子（启始复制子（ori, Origin of replication)；3.多克隆位点多克隆位点(MSC, Mul

2、tiple cloning site or polylinker)；质粒的结构：质粒的结构：n质粒是细菌内的共生型遗传因子，有相对独立性质粒是细菌内的共生型遗传因子，有相对独立性n能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型n双链闭合环状双链闭合环状DNA，分子量大小不等，分子量大小不等n质粒质粒DNA与宿主菌染色体与宿主菌染色体DNA的不同点：的不同点： 宿主菌染色体宿主菌染色体DNA比质粒比质粒DNA大大 纯化分离的宿主菌纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式呈闭合环的形式 n 基因克隆基因克隆(gene c

3、lone)的第一步（分离得的第一步（分离得 到转运目的基因的载体）到转运目的基因的载体）为基因重组为基因重组(gene recombination)作准备作准备质粒可以直接转化质粒可以直接转化(transform)细胞细胞为目的基因为目的基因(target gene)的表达提供条件的表达提供条件基因载体（基因载体（gene vector）在细胞中能大量繁殖在细胞中能大量繁殖polylinker核酸分离纯化的一般原则：核酸分离纯化的一般原则： n 保证核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整n 排除其他分子的污染：排除其他分子的污染： 蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属

4、 离子、外源离子、外源DNA、RNA等等分离纯化质粒分离纯化质粒DNA的方法的方法 SDS碱裂解法、煮沸法、碱裂解法、煮沸法、high pure plasmid isolation kit等。等。原理：利用两种原理：利用两种DNA的差异来分离的，的差异来分离的， 基本的步骤：基本的步骤： 培养细菌使质粒扩增（培养细菌使质粒扩增（DNADNA的扩增与选择的扩增与选择 细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解 收集收集高速离心的方法高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水热裂法、溶菌酶法、超声碱变性法、沸水热裂法、溶菌酶法、超声 处理法等。根

5、据质粒的大小、宿主菌菌株处理法等。根据质粒的大小、宿主菌菌株 及裂解后的纯化方法等因素综合后加以选择及裂解后的纯化方法等因素综合后加以选择 质粒质粒DNADNA的纯化的纯化 常用的方法：超速离心、层析法、常用的方法：超速离心、层析法、 聚乙二醇沉淀法等聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒DNADNA相对较小及共价闭合相对较小及共价闭合环状的性质。环状的性质。 SDS碱裂解法制备质粒碱裂解法制备质粒DNA的原理：的原理：SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以裂解，又能使一些蛋白质变性

6、，所以SDS处理细处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒粒DNA以及基因组以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。从细胞中同时释放出来。 释放出来的释放出来的DNA遇到遇到强碱性强碱性（NaOH）环境，就会变）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾、冰醋酸来中和溶液，使溶性。然后，用酸性乙酸钾、冰醋酸来中和溶液，使溶液处于中性，质粒液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。由于分子巨大，难以复性。 离心后，质粒离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组将在上清中，而基因组DNA则与细则与细胞碎片一起

7、沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒将质粒DNA从细菌中提取出来。从细菌中提取出来。SDS碱裂解法抽提质粒的主要试剂碱裂解法抽提质粒的主要试剂n溶液溶液 组成组成: 葡萄糖葡萄糖、EDTA、TrisCl. 葡萄糖：葡萄糖：增加溶液的粘度增加溶液的粘度,减少抽提减少抽提 过程中的机械剪切作用过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒. EDTA ：络合镁等二价金属离子，防止：络合镁等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用酶对质粒分子的降解作用 TrisCl：能使溶菌液维持溶菌作用的能使溶菌液维持溶菌作用的最适最适PH范围。范围。n溶

8、液溶液II组成：组成：SDS（十二烷基硫酸钠），（十二烷基硫酸钠），NaOH SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性；变性； NaOH：破坏氢键，使：破坏氢键，使DNA分子变性。分子变性。n溶液溶液III组成：组成：乙酸钾乙酸钾，冰醋酸冰醋酸，中和溶液中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNA复性而发复性而发生缠绕并使质粒生缠绕并使质粒DNA复性。复性。实验步骤及注意事项：实验步骤及注意事项：1人人1份菌液份菌液(PUC119)加加1.5ml培养物于培养物于EP管，管，12 000rpm1min 弃上清，倒置弃上清，倒置EP管于吸水纸上使液体流尽。管

9、于吸水纸上使液体流尽。 加入加入100ul溶液溶液I重悬沉淀，剧烈震荡重悬沉淀，剧烈震荡EP管，摇匀。管，摇匀。 加入加入200l溶液溶液II，快速温和颠倒数次，快速温和颠倒数次加入加入150 l冰冷溶液冰冷溶液III，颠倒，颠倒10s，冰浴，冰浴4min， 12000rpm5min 转移转移上清上清到到新新EP管管，加入，加入400ul等体积的酚混等体积的酚混匀匀,12000rpm 5min 转移转移上清上清到到新新EP管管，加入，加入400ul等体积的氯仿等体积的氯仿/异戊醇异戊醇混匀混匀,12000rpm 5min 转移转移水相水相至至新新EP管管，加，加800ul两倍体积两倍体积无水乙

10、醇，混无水乙醇，混匀，匀，12000rpm5min 弃弃上清上清，倒置管于吸水纸上使液体流尽，沉淀中加，倒置管于吸水纸上使液体流尽，沉淀中加入入1ml 70%乙醇，乙醇， 12000rpm5min去上清，静置去上清，静置5min干燥干燥,TE 20 l 溶解质粒溶解质粒，双酶切体系：双酶切体系： ddH2O 6l 质粒质粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l 合计合计 20l 注意事项：注意事项：n加样枪正确使用加样枪正确使用n吸取酚时吸头要伸到下层溶液中，不要沾到吸取酚时吸头要伸到下层溶液中，不要沾到皮肤皮肤n废液倒在水池中，吸头弃到垃圾桶中废液倒在水池

11、中，吸头弃到垃圾桶中n加不同溶液要换吸头加不同溶液要换吸头n离心前把管擦干离心前把管擦干n转移上清时动作要轻，不要吸到沉淀转移上清时动作要轻，不要吸到沉淀重组质粒的酶切鉴定重组质粒的酶切鉴定BamH、Hind切割重组质粒双酶切体系：双酶切体系： ddH2O 6l 质粒质粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l 合计合计 20l 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n限制性核酸内切酶是识别限制性核酸内切酶是识别DNADNA的特异序列的特异序列, , 并在识别位点或其周围切割双链并在识别位点或其周围切割双链DNADNA的一的一类内切酶。类内切酶。n分类分类、（基因工

12、程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）n作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识

13、别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口实验步骤：实验步骤：1、胶带封制胶板两端、胶带封制胶板两端2、放好梳子，等胶稍稍冷却后灌胶、放好梳子，等胶稍稍冷却后灌胶3、待胶凝固后撕去胶带，将制胶板放在电泳槽、待胶凝固后撕去胶带，将制胶板放在电泳槽中，中， 轻轻拔掉梳子轻轻拔掉梳子4、加样加样，每人，每人2孔孔，1孔质粒，孔质粒，1孔酶切产物孔酶切产物5、接通电源，开始电泳（、接通电源，开始电泳（

14、120V）;6、蓝色条带快到终点时停止电泳；、蓝色条带快到终点时停止电泳；7、紫外灯下观察结果。、紫外灯下观察结果。点样点样n孔人孔人1 酶切前酶切前DNA 10ul + 2ul上样上样buffer 全部上样全部上样2 酶切后酶切后DNA 20ul + 4ul上样上样buffer 20ul上样上样1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 实验结果实验结果酶切后直接进行电泳检测，下图是较好的酶切结果。酶切后直接进行电泳检测，下图是较好的酶切结果。LC型质粒型质粒DNA点样孔点样孔细菌基因组细菌基因组DNAOC 型质粒型质粒DNASC 质粒质粒DNA细菌细菌RNA常见问题常见问题1、提取的、提取

15、的DNA不纯：变性不充分；关键过程反应不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。时间过短；离心时间或速度不够。2、提取的、提取的DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。动作粗暴；操作系统有污染。3、与染色体、与染色体DNA分离不全；变性过程不完全；试分离不全；变性过程不完全；试剂配置有问题。剂配置有问题。思考题思考题1. 染色体染色体DNA与质粒与质粒DNA分离的主要依据是什么？分离的主要依据是什么？2. 如果一个如果一个DNA 酶解液在电泳后发现酶解液在电泳后发现DNA 未被切动未被切动, 你认为可能是什么原因？你认为可能

16、是什么原因？3. 琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶电泳中DNA 分子迁移率受哪些因素的分子迁移率受哪些因素的影响？影响？【实验目的【实验目的】 掌握掌握752型紫外分光光度计的使用；学习型紫外分光光度计的使用；学习用紫外分光光度法测定用紫外分光光度法测定DNA的含量。的含量。分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。行定性、定量分析的实验技术。是基于被测物质的分子是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。n特点特点 n灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达

17、105106mol/L, n准确度准确度 能够满足微量组分的测定要求：能够满足微量组分的测定要求： 相对误差相对误差25 （12）n操作简便快速操作简便快速n应用广泛应用广泛电磁波谱电磁波谱氢灯氢灯 复合光复合光(阳光及钨灯阳光及钨灯)发射光谱发射光谱红红 橙橙 黄黄 绿绿 青青 蓝蓝 紫紫单色光单色光三棱镜三棱镜可见光分光光度计光源可见光分光光度计光源紫外分光光度计光源紫外分光光度计光源高高低低光学光谱区光学光谱区远紫外远紫外近紫外近紫外 可见可见近红外近红外中红外中红外 远红外远红外（真空紫外）（真空紫外）10nm200nm 200nm380nm380nm780nm780nm2.5 m2.

18、5 m50 m50 m300 m吸收光谱吸收光谱在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的溶液的吸收光谱吸收光谱。苯苯和和甲苯甲苯在环己烷中的吸收光谱在环己烷中的吸收光谱苯苯(254nm)甲苯甲苯(262nm)A 230 250 270 光吸收基本定律光吸收基本定律: Lambert-Beer定律定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxI I-dIs朗伯定律朗伯定律(1760)(1760) A=lg(I0/It)=k1b比尔定律比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度吸光度介质厚介质厚度度(cm)Lambert-Beer定律定律 A或或DK C L 吸光度吸光度 摩尔消光系数摩尔消光系数 吸收物质的光径（吸收物质的光径（cm） 溶液浓度（溶液浓度（mol/L） 原理原理 核酸或核苷酸中的碱基共轭双键核酸或核苷酸中的碱基共轭双键 对对260nm紫外光有紫外光有特异性吸收，吸收强度与核酸浓度成正比。特异性吸收，吸收强度与核酸浓度成正比。 紫外光谱分析法紫外光谱分析法 分光光度计法定量分光光度计法定量DNA1. 取取10 l样品样品DNA，加入，加入4ml0.1xTE对待测对待