HPLC(仪器图)

1、2022-3-16 高效液相色谱法高效液相色谱法( (HPLC) )high performance liquid chromatograph2022-3-16 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是）是2020世纪世纪6060年代末年代末7070年代年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在经典液初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了用了高压驱动流动相高压驱动流动相 、高效固定相和高灵敏度、高效固定相和高灵敏度检测检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动器，因而具

2、备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。化的特点。概述概述2022-3-16发展：发展： 1960 1960年代，由于气相色谱对高年代，由于气相色谱对高沸点沸点有机物分析的局限性，有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。2020世纪世纪6060年代末科克兰（年代末科克兰（KirklandKirkland）、荷瓦斯）、荷瓦斯(Horvath)(Horvath)、莆黑斯、莆黑斯、哈伯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱哈伯、里普斯

3、克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。仪，开启了高效液相色谱的时代。 2022-3-16高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。在几个小时甚至几十分钟内完成。 19711971年科克兰等人出版了年科克兰等人出版了液相色谱的现代实践液相色谱的现代实践一书，标志着高效液相色谱法一书，标志着高效液相色谱法 (HPLC)(H

4、PLC)正式建立。正式建立。 2022-3-16 19701970年后，适合分离生物大分子的填料年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。又成为研究的热点。19801980年后，改善分年后，改善分离的选择性成为离的选择性成为色谱色谱工作者的主要问题，工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成提人们越来越认识到改变流动相的组成提高选择性的关键。高选择性的关键。 2022-3-16主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典经典LCLC：仅做为一种分离手段仅做为一种分离手段 柱内径柱内径1-3cm1-3cm，固定相粒径固定相粒径100m 10

5、0m 且不均匀且不均匀 常压输送流动相常压输送流动相 柱效低（柱效低（HH，nn） 分析周期长分析周期长 无法在线检测无法在线检测2 2HPLCHPLC：分离和分析分离和分析 柱内径柱内径2-6mm2-6mm，固定相粒径固定相粒径10m10m（球形，匀浆装柱）球形，匀浆装柱） 高压输送流动相高压输送流动相 柱效高（柱效高（HH，nn） 分析时间大大缩短分析时间大大缩短 可以在线检测可以在线检测2022-3-162022-3-161 1分析对象分析对象 GCGC： 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高沸点、挥发性差

6、、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测高聚物的样品不可检测 占有机物的占有机物的20%20% HPLC HPLC： 溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制稳定性的限制 , ,分子量大、难气化、热稳定性差分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测及高分子和离子型样品均可检测, ,用途广泛，占有用途广泛，占有机物的机物的80%80%2022-3-16相同：兼具分离和分析功能，均可以在相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的主要差别：分析对象的差别和流动相的差别差别2022-3-1

7、62 2流动相差别流动相差别vGCGC：流动相为惰性气体流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLCHPLC：流动相为液体流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相极性和流动相极性和pHpH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用 3 3操作条件差别操作条件差别 GCGC： 加温操作加温操作 HPLCHPLC：室温；高压

8、（液体粘度大，峰展宽小）室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）2022-3-16 高效液相色谱仪的结构示意图：一般可分为五个主高效液相色谱仪的结构示意图：一般可分为五个主要部分：要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统高压输液系统，进样系统，分离系统, ,检测系统和数据处理及控制系统检测系统和数据处理及控制系统。此外还配有。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪2022-3-16第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪2022-3-162022-3-162022-3-16 Agilent 120

9、0液相色谱系统液相色谱系统 2022-3-162022-3-16 高效液相色谱仪的仪器流程高效液相色谱仪的仪器流程(process and main assembly of HPLC)高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据采集和控制系统据采集和控制系统2022-3-162022-3-161.1.高压输液系统高压输液系统高压输液泵高压输液泵: :主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：151535 35 MPaMPa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（1010mm），），液液体的流动相高速通过时，将

10、产生很高的压力，因此高压、高体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性（动画）（动画）(二二).主要部件主要部件2022-3-16 流动相的预处理：流动相的预处理： 在使用前必须进行脱气处理，以防止在洗脱过程在使用前必须进行脱气处理，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡而产生气泡 抽真空脱气抽真空脱气 吹氦脱气吹氦脱气 加热回流脱气加热回流脱气 超声波脱气超

11、声波脱气2022-3-16 等强度洗脱（等强度洗脱（isocratic):isocratic):样品的组成较简单，样品的组成较简单，各组分的分配系数值相差不大。在同一分析周各组分的分配系数值相差不大。在同一分析周期内流动相的组成保持恒定。期内流动相的组成保持恒定。 梯度洗脱（梯度洗脱（gradient)gradient)：样品的组成较复杂，各：样品的组成较复杂，各组分的分配系数值相差大，即宽分配比的组分组分的分配系数值相差大，即宽分配比的组分流动相的洗脱方式流动相的洗脱方式2022-3-16梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的基本原理梯度洗脱的基本原理梯度

12、洗脱（溶剂程序）：在同一个分析周期内按梯度洗脱（溶剂程序）：在同一个分析周期内按一定的程序改变流动相的组成一定的程序改变流动相的组成, ,从而改变流动相从而改变流动相极性、离子强度、极性、离子强度、pHpH，来调整组分的，来调整组分的k k值，改变值，改变分离因子分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。的目的。梯度洗脱（梯度洗脱（gradient)2022-3-161 1 1 1 1 1梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点（1 1）提高分离度，加快分析速度；）提高分离度，加快分析速度；（2 2）改善峰形）改

13、善峰形, , 减少拖尾减少拖尾, ,（3 3）提高检测的灵敏度，）提高检测的灵敏度， 有利于痕有利于痕量组分的检测；量组分的检测；（4 4）增加峰容量；）增加峰容量；（5 5）强烈滞留的组分不容易残留在柱）强烈滞留的组分不容易残留在柱上上, , 保持柱性能长期良好；保持柱性能长期良好；梯度洗脱的作用梯度洗脱的作用2022-3-16(2)(2)(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度: : 利用两台高压利用两台高压输液泵，将两种不同极输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合送入梯度混合室，混合后进入色谱柱后

14、进入色谱柱。内梯度内梯度: :一台高压泵一台高压泵, , 通通过比例调节阀过比例调节阀, ,将两种或将两种或多种不同极性的溶剂按多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵一定的比例抽入高压泵中混合。中混合。2022-3-162 2 2梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的主要条件 A A 流动相流动相/ /弱溶剂组成；弱溶剂组成； B B 流动相流动相/ /强溶剂组成；强溶剂组成； 梯度时间；梯度时间； 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。梯度曲线：线性、凸型或凹型等。强溶剂 A%time1252022-3-16 流路中为高压力工作状态，通

15、常使用耐高压的六通流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：阀进样装置，其结构如图所示：2.2.进样系统进样系统2022-3-162022-3-16六通阀定量环六通阀定量环LoadLoadLoadInjectInjectInjectInjectInjectInject通废液口通废液口进柱进柱定量环定量环手动进样器、六通阀、定量环手动进样器、六通阀、定量环2022-3-16仪器：自仪器：自仪器：自动进样器动进样器动进样器机械手样品盘自动进样器自动进样器自动进样自动进样100样品盘、机器手、自动洗样品盘、机器手、自动洗针针2022-3-16高效分离柱高效分离柱:柱体为

16、直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。分离系统分离系统分离系统分离系统分离系统分离系统2022-3-16柱温箱外挂架色谱柱、柱温箱、色谱柱外挂架色谱柱、柱温箱、色谱柱外挂架2022-3-164.4.4.4.4.4. 检测系统检测系统检测系统检测系统检测系统检测系统 a. a. 紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：特点： 灵敏度高；灵敏度高； 线形范围高；线形范围高； 流通池可做的很小（流通池可做的很小（1 1mm

17、 mm 10mm 10mm ，容积容积 8 8LL）；）； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 2022-3-16b. b. b. b. b. b. 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：10241024个二极管阵列，各检个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。图所示。2022-3-16 光电

18、转换元件是光电转换元件是: :光电二极管光电二极管, ,即晶体硅即晶体硅( (体积体积仅仅50ul),50ul),如如Agilent 1100Agilent 1100型光电二极管阵列检型光电二极管阵列检测器测器, ,波长范围为波长范围为190-950nm190-950nm对应对应10241024个光电二个光电二极管极管, ,平均平均0.74nm0.74nm谱带区间谱带区间, ,由一个光电二极管由一个光电二极管接收接收. .光电二极管阵列检测器构造光电二极管阵列检测器构造2022-3-162022-3-16当复合光透过流通池后当复合光透过流通池后, ,被组分吸收被组分吸收, ,其透过光具有其透过

19、光具有了组分的光谱吸收特征了组分的光谱吸收特征. .此透过光被光栅分光后此透过光被光栅分光后, ,形形成组分的吸收光谱成组分的吸收光谱, ,照到光电二极管阵列装置上照到光电二极管阵列装置上, ,使使每个纳米光波的光强转化为相应的电信号每个纳米光波的光强转化为相应的电信号, ,给出组分给出组分的吸收光谱的吸收光谱. .本检测器可以同时获得样品的色谱图本检测器可以同时获得样品的色谱图(C-t)(C-t)及每个色及每个色谱峰的吸收光谱谱峰的吸收光谱(A-(A-入入),),得到三维光谱得到三维光谱- -色谱图色谱图, ,可以可以同时得到定性和定量及色谱峰是否单一组分的信息同时得到定性和定量及色谱峰是否

20、单一组分的信息. .2022-3-162022-3-16c. c. c. 示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive index detectordifferential refractive index detectordifferential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；差值与浓度呈正比；

21、通用型检测器（每种物质通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型偏转式、反射式和干涉型三种；三种；2022-3-16示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器2022-3-16 高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B B、黄曲黄曲霉素、卟啉类化合物、农药霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；物等有响应；荧光检测器荧光检测器 （fluoresc

22、ence detector）2022-3-16 此类检测器是上世纪此类检测器是上世纪9090年代出现的最新型的泛年代出现的最新型的泛用检测器用检测器. .可用于挥发性低于流动相的任何样可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测品组分的检测. .但灵敏度低于紫外光度型但灵敏度低于紫外光度型. .因而因而主要用于糖类主要用于糖类, ,高分子化合物高分子化合物, ,高级脂肪酸及甾高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物体类等几十类化合物. . 构造构造 检测机理检测机理蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSD）evaporative light scattering detector2022-3-16步

23、骤一步骤一 ：雾化：雾化 柱洗脱液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和氮气混合形成均匀柱洗脱液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和氮气混合形成均匀的微小雾状液滴的微小雾状液滴 步骤二：流动相的蒸发步骤二：流动相的蒸发 液滴流经加热的漂移管时，流动相蒸发，样品在溶剂蒸气中液滴流经加热的漂移管时，流动相蒸发，样品在溶剂蒸气中形成雾状微小颗粒，悬浮在溶剂蒸气中形成雾状微小颗粒，悬浮在溶剂蒸气中步骤三：检测步骤三：检测 样品小颗粒进入流动池时，经过一束激光样品小颗粒进入流动池时，经过一束激光, ,颗粒散射激光颗粒散射激光, ,经硅晶体光电经硅晶体光电二极管检测散射光，并产生电信号二极管检测散射光，并产

24、生电信号。2022-3-16构造构造构造lglglgbIkmIbmk构造构造2022-3-16检测机理检测机理检测机理 1.1.雾化过程雾化过程: :形成细小均形成细小均匀的雾状液滴匀的雾状液滴 2.2.流动相蒸发过程流动相蒸发过程: :流动流动相蒸发相蒸发, ,样品分子形成雾样品分子形成雾状颗粒状颗粒. . 3.3.检测过程检测过程:670nm:670nm激光激光束的照射束的照射, ,产生散射光产生散射光, ,其被硅晶体光电二极管其被硅晶体光电二极管产生电信号产生电信号工作原理工作原理lglglgbIkmIbmk2022-3-16五五五 色谱工作站色谱工作站计算机：控制显示计算机：控制显示五五.数据记录系统和控制系统数据记录系统和控制系统2022-3-16流 动 相流 动 相供 给 和