反向寡脱氧核苷酸抑制细胞周期素D1表达及对黑素瘤细胞增殖的影响

1、. 反向寡脱氧核苷酸抑制细胞周期素D1表达及对黑素瘤细胞增殖的影响反向寡脱氧核苷酸抑制细胞周期素D1表达及对黑素瘤细胞增殖的影响中华皮肤科杂志 1999年第4期第32卷 论著作者：陆前进苏先狮夏家辉魏启幼张其亮王振明祝和成施家琦黄柏英赵云夏昆单位：410011长沙，湖南医科大学附属第二医院(陆前进苏先狮魏启幼张其亮王振明赵云)，中国医学遗传学国家重点实验室(夏家辉施家琦夏昆)，癌变原理卫生部重点实验室(祝和成黄柏英)关键词：黑色素瘤核酸；反义细胞周期蛋白类【摘要】目的探讨细胞周期素D1反向寡脱氧核苷酸对恶性黑素瘤的潜在治疗作用。方法合成针对细胞周期素D1mRNA翻译起始部位序列的20bp硫代磷

2、酸反向寡脱氧核苷酸(AS-ODN)。采用RT-PCR检测AS-ODN对黑素瘤(B16细胞)细胞周期素D1 mRNA水平的影响；用流式细胞仪检测细胞周期素D1蛋白表达及细胞周期分布；固绿染色计数、集落形成抑制试验体外观察AS-ODN对B16细胞增殖的影响。结果细胞周期素D1mRNA反向链明显抑制B16细胞细胞周期素D1mRNA和细胞周期素D1蛋白表达，降低S期细胞百分比，且明显抑制B16细胞生长和集落形成。结论细胞周期素D1反向寡脱氧核苷酸能有效抑制黑素瘤细胞增殖。Antisense Oligodeoxynucleotide Inhibits the Expression of Cyclin D

3、1 and Its Influence on Growth of Melanoma CellsLU Qianjin, SU Xianshi, XIA Jiahui, et al.Second Affiliated Hospital, Human Medical University, Changsha 410011【Abstract】Objective To explore the therapeutic potential of antisense oligodeoxynucleotide to cyclin D1 for malignant melanoma.Methods Three 2

4、0-mers phosphorothioate oligodeoxynucleotides (ODNs) were synthesized: (1)Cyclin D1 antisense ODN (AS-ODN) targeting the initiation site of translation in cyclin D1 mRNA;(2)Cyclin D1 sense ODN(S-ODN) homologous to the initiation site of translation in cyclin D1 mRNA;(3)Random ODN (R-ODN). The level

5、of cyclin D1 mRNA was observed by RT-PCR. The level of cyclin D1 protein and the distribution of cell cycle progression were examined by flow cytometry. The inhibitory effect of ODN for the growth of melanoma (B16) cells was observed by solid green staining and colony forming inhibitory test.Results

6、 AS-ODN inhibited obviously the level of cyclin D1 mRNA expression while S-ODN and R-ODN did not. The level of cyclin D1 protein was significantly lower in AS-ODN treated cells than that in controls (P0.05). AS-ODN inhibited B16 cells entering S phase from G1 phase, however, both S-ODN and R-ODN had

7、 no such effect. Cells treated with AS-ODN, S-ODN, R-ODN displayed a colony forming inhibitory rate of 63.64, 18.19, and 31.82, and a cell growth inhibitory rate of 64.73, 26.51, and 29.64, respectively.Conclusion Cyclin D1 antisense oligodeoxynucleotide has strong inhibitory effect on the growth of

8、 melanoma cells.【Key words】 Melanoma Oligodeoxynucleotide, antisense Cyclins近几年对细胞周期调控研究具有突破性的进展之一是确立了细胞周期素(cyclin)的周期性累积与分解对细胞周期进程的调控作用。目前的研究表明，cyclinD1在细胞周期G1/S转换过程中起重要作用。cyclinD1的过表达可加速细胞进入S期，在许多恶性肿瘤组织中都有cyclinD1的过表达。本研究试图利用反向技术阻断cyclinD1表达以抑制黑素瘤细胞增殖。材料与方法1.试剂：TaqDNA聚合酶，M-MLV逆转录酶，TrizolTM及RNasin购

9、自Gibco/BRL公司。PGEM?3zf/Hae分子量标准及DEPC购自上海华美公司。鼠抗cyclinD1单抗购自深圳晶美生物工程公司，FITC羊抗鼠二抗购自ANCELL公司。2.硫化磷酸寡脱氧核苷酸(ODN)的设计与合成：针对cyclin D1 mRNA翻译起始部位上、下游序列，设计20聚互补和同源的ODNs，并设计由20个核苷酸组成的随机ODN，3条ODN全硫代磷酸化，由上海Sangon生物工程公司合成。3条ODN序列为：反向链(AS-ODN)：5-AGGAGCTGGTGTTCCATGGC?3；正向链(S-ODN)：5-GCCATGGAACACCAGCTCCT-3；随机链(R-ODN)：

10、5-TCAGATCAGGCCTCGATACT-3。3.RT-PCR引物：采用DNAStar软件设计，cyclin D1 mRNA引物正链为：CTGGATGCTGGAGGTCTGTGAGGAnt323346；负链为：CTGGCATTTTGGAGAGGAAGTGTTnt622645。肌动蛋白引物正链为：ATCGTGCGTGACATCAAAGAGAAGnt702725；负链为：CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGAGnt859881。扩增产物分别为323bp和180bp。由上海Sangon生物工程公司合成。4.细胞培养：鼠黑素瘤B16细胞(第二军医大学免疫学教研室惠赠)，用含10小牛血清DME

11、M培养基培养，57d传代1次。5.细胞生长抑制试验：用完全DMEM培养液将细胞浓度调整为1105/mL，接种于96孔培养板，每孔100L(1104个细胞)。8h后加不同浓度的AS-ODN、S-ODN和R-ODN，空白对照组为不含ODN的培养液。在不同时间(672h)每组、每浓度分别用固绿染色计数3次，取均值。按下式计算抑制率：细胞生长抑制率=(NnN)/(NnN0)100。式中Nn、N分别为空白对照组、实验组n小时后细胞计数，N0为初始细胞计数。6.集落形成抑制试验：每皿含DMEM培养基5mL，接种100个细胞。8h后每皿分别加入75gAS-ODN、75gS?ODN和75gR-ODN。终浓度均

12、为15g/mL。空白对照组不含ODN。培养8d，计算集落数，50个细胞以上为一个集落。7.B16细胞总RNA提取：采用一步法。cyclinD1mRNA水平用RT-PCR检测，以B16细胞总RNA为模板，肌动蛋白mRNA为参照，按常规进行RT-PCR。8.流式细胞仪检测cyclinD1蛋白表达水平和细胞周期分布：FACSVantage流式细胞仪为Becton/Dickinson产品，检测方法按参考文献方法进行。结果(一)cyclinD1反向寡脱氧核苷酸对B16细胞cyclinD1mRNA表达的影响：RT-PCR结果见扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，每份标本出现了323bpcyclinD1cDNA条带

13、和180bp肌动蛋白cDNA条带(图1)。经光密度扫描半定量分析，AS-ODN、S-ODN及R-ODN处理的B16细胞cyclinD1mRNA与内参照肌动蛋白mRNA的光密度比值分别为0.40、0.74和0.67。1：S-ODN组，2：R-ODN组，3：AS-ODN组，4：野生型组，5：PGEM-3Zf(t)/Hae分子量标准1细胞周期素D1mRNA的RT-PCR产物电泳分析(二)cyclinD1反向寡脱氧核苷酸对B16细胞cyclinD1蛋白表达的影响：AS-ODN处理B16细胞48h后，细胞内cyclinD1蛋白水平明显低于空白对照组野生型B16细胞(P0.01),而S-ODN、R-ODN

14、处理的B16细胞cyclin D1蛋白水平与对照组野生型B16细胞比较差异无显著性（P均0.05，见表1)。表1硫代磷酸寡脱氧核苷酸(ODNs)对B16细胞细胞周期素D1蛋白及细胞周期分布的影响B16细胞处理组细胞周期素D1蛋白荧光强度G1期（%）S期（%）stt值均值U值均值U值野生组101.2551.3333.7212.27反向链-ODN处理组45.7219.025.8953.3539.595.2224.95正向链-ODN处理组84.3737.661.2140.2813.5716.6012.31随机链-ODN处理组77.5241.111.5944.1021.2812.611.01注：与野生

15、组比较P0.01(三)cyclinD1反向寡脱氧核苷酸对B16细胞细胞周期分布的影响：AS-ODN处理B16细胞48h后，与未经任何ODN处理的野生型B16细胞比较，G1期细胞百分比增高(P0.01),而经S-ODN、R-ODN处理的B16细胞，其G1期细胞百分比虽有增高，但S期细胞百分比并无降低，反而有所增加，见表1。(四)cyclinD1反向寡脱氧核苷酸对B16细胞生长的抑制作用：AS-ODN对B16细胞生长有明显抑制作用，剂量15g/mL的AS-ODN对B16细胞生长抑制率达64.73。该作用在加药后6h出现，48h达高峰。而S-ODN、R-ODN对B16细胞生长抑制率分别为26.51、

16、29.69。AS-ODN对B16细胞生长抑制作用呈剂量依赖性，在115g/mL内，抑制作用呈剂量依赖性，在115g/mL内，抑制作用与剂量呈正相关，当剂量15g/mL时，加大AS-ODN剂量，抑制作用并不随之上升。(五)cyclinD1反向寡脱氧核苷酸对B16细胞集落形成的抑制作用：AS-ODN、S-ODN、R-ODN处理的B16细胞，8d后集落形成数目分别为40、90、75个，而对照组(未用任何ODN处理)集落数为110个。AS-ODN对B16细胞的集落形成抑制率达63.6，而S-ODN、R-ODN对B16细胞的集落形成抑制率为18.19和31.82。讨论反向寡脱氧核苷酸是近年来用于调节基因

17、表达的重要手段。它能与靶mRNA互补结合成DNA-RNA杂化体，主要通过直接抑制翻译起始，其次可能通过诱导RNaseH剪切杂化体分子中mRNA，从而抑制蛋白质合成。本研究以cyclinD1mRNA翻译起始区为靶点合成了一段反向寡脱氧核苷酸。为提高反向寡脱氧核苷酸对核酸酶的抗性，对反向寡脱氧核苷酸进行了硫代磷酸修饰。本研究结果显示，cyclinD1硫代反向寡脱氧核苷酸能明显抑制黑素瘤B16细胞cyclinD1mRNA表达和cyclinD1蛋白表达，而正向、随机寡脱氧核苷酸均对cyclinD1mRNA、cyclinD1蛋白表达无明显影响。说明反向寡脱氧核苷酸可能通过直接抑制翻译，而且通过诱导RNa

18、seH剪切DNA?RNA杂化体中mRNA，从而抑制cyclinD1蛋白合成。寡脱氧核苷酸对cyclinD1的抑制具有序列特异性。本研究发现在抑制cyclinD1mRNA和cyclinD1蛋白表达的同时，反向寡脱氧核苷酸影响细胞周期分布。cyclinD1反向寡脱氧核苷酸能够增加G1期细胞百分比，降低S期细胞百分比。说明cyclinD1反向寡脱氧核苷酸能够明显阻抑细胞周期中的G1/S转换。而正向寡脱氧核苷酸、随机寡脱氧核苷酸虽可增加G1期细胞百分比，但不降低S期细胞百分比，且S期细胞百分比有所增加，提示它们不能有效阻抑细胞周期中的G1/S转换。本研究结果cyclinD1反向寡脱氧核苷酸能够抑制黑素

19、瘤B16细胞增殖，其细胞生长抑制率、集落形成抑制率分别达64.73和63.34。该抑制作用可能是通过阻抑细胞周期中的G1/S转换来实现。cyclinD1反向寡脱氧核苷酸对黑素瘤细胞的生长抑制作用与孵育时间有关，其生长抑制作用于6h开始出现，48h达到最大效应，以后逐渐下降。这种时效关系对今后反向寡脱氧核苷酸临床应用中确定治疗间隙时间有一定的参考价值。反向寡脱氧核苷酸对B16细胞的生长抑制作用有剂量依赖性，在015g/mL范围内，抑制作用与剂量呈正相关，当剂量大于15g/mL后，抑制作用并不随之增加，其原因可能为细胞对反向寡脱氧核苷酸的摄取饱和之故。此外，本研究还发现正向、随机寡脱氧核苷酸对B1

20、6细胞的生长亦有一定的抑制作用，该抑制作用可能为非反向效应所致。目前研究发现寡脱氧核苷酸所产生的生物学效应，不仅有反向效应，还存在非反向效应。参考文献1 Baldin V, Lukas J, Marcote MJ, et al. Cyclin D1 is a nuclear protein required for cell cycle progression in G1. Genes Dev, 1993,7:812 821.2 Resnitzky D, Gossen M, Bujard H, et al. Acceleration of G1/S phase transition by ex

21、pression of cyclin D1 and E with an inducible system. Mol Cell Biol, 1994,14:1669 1679.3 Jian W, Kahn SM, Zhou P, et al. Overexpression of cyclin D1 in rat fibroblasts causes abnormalities in growth control:cell cycle progression and gene expression. Oncogene, 1993,8:3447 3457.4 杨林，张定凤，王玉芝，等.抗基因及反义寡脱核苷酸抑制N-nas表达及对肝癌细胞增殖的影响.中华肝脏病杂志,1996,4:203206.5 戴木水，罗绍凯，戴丽君，等.反义bcr/abl寡核苷酸诱导K56