多能干细胞定向分化的表观遗传学调控网络

1、精品文档项目名称：多能干细胞定向分化的表观遗传学调控网络首席科学家：沈晓骅清华大学起止年限：2012.1 至 2016.8依托部门：教育部。1欢迎下载精品文档一、关键科学问题及研究内容、拟解决的关键科学 问题干细胞分 化和个 体发育 伴随着 表观遗 传状态、 染色质 结构和 基因表 达的改变。多 能干细 胞（包 括 ESCs 和 iPSCs ）代 表哺乳 动物细 胞的一 种最初 状态(ground state)，被 看作是 了解分 化过 程的起 点和关 键。 因此， 对多 能干细胞定向分化和其中的分子及表观遗传学调控的研究是生命科学和再生医学领域的核心。本项目要探索的最终科学问题是：表观遗传机

2、理如何控制多能干细胞的定向分化？表观遗传机制逐步限制细胞分化和发育的潜能。多能性干细胞在分化过程中必须经历一系列表观遗传状态的改变和中间状态直至谱系确立。在此过程中，表观遗传图谱是如何建立的？换而言之，组织特异性的信号因子 、转录 因子和 RNA 分 子是如 何作用 于表观 遗传酶 机器， 引导其 建立细胞类型特异性的表观遗传修饰图谱？一旦图谱建立，细胞特有的表观遗传修饰图谱是如何解读的？即细胞特有的表观遗传修饰图谱是如何决定基因表达和细胞谱系命运的？多能性干细胞受内、外信号的影响而选择不同命运。那么，多能干细胞在分化成不同组织类型的细胞过程中，表观遗传调控网络有何异同？另外，细胞培养并不能完

3、全反映个体发育的规律。那么，同组织类型的细胞在体外分化和体内个体发育过程中的表观遗传调控网络有何异同？虽然小鼠是研究干细胞分化和哺乳动物发育极佳的模式动物，但是干细胞在再生医学中的应用需要对人类的组织细胞分化有很好的认识。那么，从进化角度来看，表观遗传调控网络在人和小鼠等物种间有何异同性？如何指导人类多能干细胞在体外高效定向分化为近似于体内发育的各种功能细胞，并促进它们的功能成熟 及提高修复损伤器官 的能力？寻找这些 关键科 学问题 的答案， 将加深 对干细 胞定向 分化和 生命个 体发育调控规 律的认 识，为 建立能 应用于 再生医 学的定 向分化 技术体 系奠定 基础 。、主要研究内容围绕

4、以上 科学问 题，我 们以表 观遗传 学调控 为中心 ，综合 运用遗 传学、分子生物学、生物化学、蛋白组学及基因组学等系统生物学技术，对体外和体内干细胞分化过程展开系统、深入的分析。首先，以多能干细胞向包括神经外胚层、心血管中胚层等体细胞和生殖细胞的分化为模型，在已建立的分化体系的 基础上 ，利用 报告基 因分离 出高纯 度的各 分化组 织细胞 系。在以上不同的分化过程中，构建以表观遗传因子为中心的分子调控网。2欢迎下载精品文档络，解析单细胞及多细胞的全基因组表达谱和表观遗传修饰谱，研究信号通路、转录 因子、 非编码 RNA 和 表观遗 传因子 之间的 相互作 用，以 及这些 互作对基因表达和

5、细胞命运的影响。这些以表观遗传因子为中心的蛋白-RNA-DNA相互关联的机制及其对全基因组转录谱的影响作用，我们通称之为表观遗传调控网络。我们将不仅从宏观系统水平上认识分化过程中的表观遗传学、转录和转录后调控，而且从分子水平上深入研究几个关键转录因子、表观遗传学酶机器 、 microRNA 和长链 ncRNA 对以 上分 化过程 的影响 。通过 对不同 分化系统的比较，了解不同组织器官的细胞谱系是如何被确立的，寻找影响定向分化的共 通的和 特异的 调控机 制。利用报告 基因、基 因敲入 和敲除 的小鼠 模型，研 究表观 遗传调 控在体 内组织发育中的作用。通过从分化组织细胞类型、动物体内外和物

6、种进化三个维度上比较表观遗传调控网络的异同，鉴定出影响多能干细胞定向分化的关键调控机制和调控分子。最后研究如何操控以上关键调控因素，获得高效、安全地诱导多能干细胞分化为神经、心血管和生殖细胞的新手段，为实际应用奠定基 础。3欢迎下载精品文档二、预期目标、总体目标本项目将 建立一 支高学 术水平 的研究 团队，充 分利用 人和小 鼠在体 内和体外研究系统的优势和互补性，重点研究多能干细胞向三种不同模式细胞分化的以表观遗传调控为中心的分子机制。在多细胞或单细胞水平上，解析多能干细胞向三种不同模式细胞分化的、细胞特有的调控因子与表观遗传因子间相互作用的图谱，解析全基因组表达谱和表观遗传修饰谱，构建以

7、调控因子与表观遗传因子的互作为中心的、关联表观遗传修饰和基因表达的表观遗传调控网络，找到控制不同分化方向的调控网络的共通点和特异性，全面系统地认识表观遗传调控对多能干细胞在体内、外及不同谱系分化、发育中的作用。筛选调控上述分化过程的关键调控因子（包括表观遗传因子、非编码RNA、转 录因子 和信号分 子）； 通过综 合调控若 干关键 因子来 优化各 分化体 系，为人工操控干细胞命运，建立高效、安全的定向分化手段提供线索，为干细胞疗法的 临床实 现提供 理论和 应用基 础。在相关领 域取得 一些理 论、方法 和技术 突破，力 争取得 具有国 际影响 的原创性成果；培养高水平研究人才，形成能够持续进

8、行创新性研究的能力；提升我国干细胞基础研究水平和国际影响力，促进我国干细胞和发育生物学学科的发 展。、五年具体目标（）建 立人和 小鼠多能干细 胞 (ESCs / iPSCs)向神经 外胚层 、心血 管中胚层和生 殖细胞的分化 和纯化 体系。（）构建 若干 基因敲入（ knockin)和报告 基因的 小鼠模 型，为 研究在 动物体内表观 遗传机 制对胚 胎发育 、器官 形成的 调控提 供实验 平台。（）绘制并比较体内外各模式细胞的全基因组表达图谱（包括蛋白编码基因、 microRNA 和长链 ncRNA）和表观遗传 修饰 图谱。（） 建 立关联 蛋白、 DNA 和 RNA 的三维调 控网络 ，

9、并 解 析细胞 特异的 调控因子（包 括蛋白 、长链 ncRNA 和 microRNA ） 与表观 遗传机 制的相 互作用。（）构建、整合及比较不同分化方向及状态的细胞的表观遗传调控网络，全面、动态 地认识 细胞命 运决定 和细胞 谱系的 特异性 与稳定 性维护 的分。4欢迎下载精品文档子机制。（）找到 影响干 细胞分 化和命 运决定 的若干 关键调 控因子（ 蛋白、 microRNA或长链 ncRNA) ；实 现向 多 巴胺能 神经元 、脊 髓运动神 经元、 心肌 、血管等组织 和生殖 细胞的 高效定 向分化 。（）预期在国际主流期刊上（影响因子IF5 ）发表 论文30 50 篇，力争 在国

10、际顶尖 学术期 刊上（包 括 Cell、Nature和 Science等）发 表论文36 篇。（ ）建立和培养一支具有国际影响力的高水平的干细胞研究梯队，争取培养国家杰 出青年基金获 得者 35 名，并 申报专利 35 项。5欢迎下载精品文档三、研究方案、总体学术思路本项目将 以人和 小鼠多 能干细 胞及小 鼠体内 干细胞 为模型 ，来探讨 生物发育和细胞分化的内在规律，并利用这些规律建立高效、安全的干细胞定向分化体系（ 如图 1）。图 1、总体学 术思路我们将对 多能干 细胞分 化成的 三种模 式细胞 谱系进 行研究 ，包括神 经外胚层和心血管中胚层在内的两类体细胞以及生殖细胞。利用并优化现

11、有的分化手段来建立分化的模式细胞系，研究和比较它们在未分化及分化状态下的信号通路、转录、转录后和染色质水平上的调控，建立以表观遗传调控为中心的涉及蛋白、DNA和 RNA 相互作用及转录表达 的四维调控网络（通称为表观遗传调控网 络）。同时 ，我 们将建 立报告基 因与基 因敲入 、敲除 的小鼠 品系 ，通过分离体内干细胞, 从个体发育的角度深入研究以表观遗传调控为中心的调控网络 如何控 制动物 体内的 神经、 心血管 和生殖 系统细 胞的形 成。6欢迎下载精品文档比较不同 分化系 统和体 内、外发 育模型 的表观 遗传调 控网络，找到控 制多能干细胞向不同方向分化的机制的共通点和特异性。不仅要

12、找到更多控制细胞命运的 关键因 子，包括 转录因 子、 microRNA 、 ncRNA 和表 观遗传 因子 , 并且全面综合地认识它们如何作用于表观遗传学修饰机制，影响转录表达，最终决定细胞谱系及功能。通过比较人与小鼠同类细胞分化过程中的调控机制的异同, 从进化的角度理解这一调控网络的演变。本项目的立项将为我们人工操控细胞 命运提 供新的 线索和 理论依 据，并 将最终 促进细 胞疗法 的临床 运用 。、技术途径我们将利 用最前 沿的技 术平台 ，结合 现代分子 生物学 、生物 化学、细 胞生物学、遗传学、发育生物学及系统生物学方法，全面系统及深入地认识控制多能干细胞向不同方向分化的分子及表

13、观遗传机制。依据体内组织器官发生的规律，我们将诱导多能干细胞分化为神经、心血管和生殖细胞，通过组织特异性荧光蛋白报告细胞系及表面抗原，分离纯化各分化阶段的神经、心血管和生殖细胞，初步建立一个稳定的高效诱导分化方案，为研究分子机制提供细胞 基础。PRC2 主导的H3K27 的三 甲基化 （ H3K27me3） 代表一 类重要 的表观 遗传抑制机制。它们调控几乎所有与干细胞增殖和分化相关的发育过程，包括神经、 心血 管及生 殖器官 的形成 ，对 ESCs 的分 化起不 可缺少 的作用。 因此， 我们将以 PRC2 为中心 ，研 究表观 遗传学 调控在 多能干 细胞定 向分化 和胚胎 发育中的作用

14、。我们 将用一种新的手 段，利 用生物素（biotin）和 FLAG 双标计内 、外源的PRC2,来对PRC2 复合物 进行 蛋白质 组学（ tandem protein complexpurificationcoupledwithmassspecmicrosequencing）、 基 因 组 学(RNA-seq 、 ChIP-seq 和 RIP-seq) 、分子 及细 胞、生 物化学 的分析。 我们 首先利用人和 小鼠 ESCs 的分 化模型 ，研究 PRC2 在神经、 心血管 和生殖 系统中 如何与蛋白 、 RNA和 DNA结 合和相 互作用 。在利 用体外 细胞培 养的同 时，我 们将建

15、 立 基 因 敲 入 的 （ knock-in ） 小 鼠 品系 ， 表 达 受 内 源 启 动 子控 制的 生 物素(biotin)和 FLAG 双标 计的PRC2蛋白 ,为研 究动物 体内胚 胎发育、器官形成的分子机 理提供 实验平 台。此外 ，利用 我们在 小鼠 PRC2表观 遗传学 和 microRNA系统方面的优势，我们将建立一系列转基因小鼠品系，使它们既有神经、心血管或生 殖细胞 特异性 荧光蛋 白报告 体系，也同时表达 带标记的PRC2 组分 或条件性microRNA全敲除 系统， 研究表 观遗传 调控和microRNA在体 内发育 中的作用。对以上体 外、体 内不同分化模型 及

16、小鼠 早期胚 胎发育 ，利用 单、多细胞。7欢迎下载精品文档microRNA和转录 组分析技术（ single-cell RNA-seq），全面分析多 能干细 胞在体内、 外 定向分 化过程 中全基 因组水 平的蛋 白编码 基因、 ncRNA 和 microRNA的表达。 利用ChIP-Seq技术分析 重要表 观遗传 修饰谱 （包 括 H3K27me3）。此外，我们 将对 几个在神经、生 殖系 统特异表达的RNA结合 蛋白（ 包括Musahi 、HuD、 FMRP、 PELOTA、 DAZL 和 VASA 等）进行RNA免 疫共沉 淀和高 通量测 序分析（ RIP-seq），来筛 选调 控神经

17、 、生 殖系统 分化 的重要ncRNA,阐明它 们的生理功能。通过分析 不同分 化阶段 各类细 胞的mRNA、microRNA 和 ncRNA 表达谱、 PRC2靶区域和 结合蛋 白及 ncRNA，以及 表观遗 传修饰 谱，利用 系统生 物学网 络构建的方法，整合以上信息，建立以表观遗传调控为中心的涉及蛋白质、DNA和 RNA 相互 作用及 转录表 达的四 维表观 遗传 调控网络 。从 宏观系统 水平上 全面 、动态地认 识信号 通路、 转录因 子、非 编码 RNA 和表观 遗传因 子之 间的相 互作用， 它们如 何介导 表观 遗传学 酶机器 PRC2 的募集和 表观遗 传标记 的建立， 以及

18、这些互作对基因表达和细胞命运的影响。构建在不同分化系统和体内、外发育模型的表观遗传调控网络，通过比较这些网络，认识它们的共通点和特异性，寻找影响定向分化的网络中心或节点，筛选出更多的控制细胞命运的关键因子 ，包括 信号因 子、转 录因子 、 microRNA 、 ncRNA 和表观遗 传因子 。结合过表 达、 RNA干 扰及 基因敲 除等技 术，研 究关键 因子在 分化过 程中的功能及它 们与表 观遗传 机制的 相互作 用。包 括转录 因子、 microRNA 和 ncRNA 是如何控制表观遗传机制来建立特定的表观遗传状态，而表观遗传机制又是如何调控转录表达的。通过比较人和小鼠多能干细胞分化过

19、程中转录因子、 microRNA 和表观 遗传机 制互作 网络的 异同 , 从进 化角度 深入理 解表 观遗传 为中心的调控网络在干细胞分化过程中的作用。最后，我们将把研究成果转化到人类 ESCs 定向分 化的 体系中 , 优化 培养条 件，利 用 mRNA 转染、 化学小 分子诱导等先进技术，争取最大限度地提高人类多能干细胞向各种神经、心血管和生殖组织定向分化的效率和安全性，并通过动物移植模型验证分化细胞的功能。3、课题设置本项目运 用人和 小鼠的 多能干 细胞，构建及 比较不 同分化 系统和 体内、外发育模型 的表观 遗传调 控网络 ，从系统 和分子 水平上 研究控 制多能 干细胞 向不同

20、方向分 化的分 子机制 ，通过认识 调控机 制的 共通点 和特异 性，找到 更多控 制细胞命运 的关 键 因子 ，并且深入 研究它 们如何 作用于 表观遗 传修饰 机器 ，影响转录表达 和最终 决定细 胞谱系 及功能 。最 后，研究 如何通 过操控 决定 细胞命 运的关键因 子或机 制，提高 人类多 能干细 胞向各 种神经 、心血管和 生殖 细胞分 化。8欢迎下载精品文档的效率和 安全性 。基 于这 样的思 路，同时考 虑项 目团队 成员的 研究方向的共 性，我们设置 四个课 题：（ ）多能干细胞向体细胞（ 包括神 经外胚 层及心 血管中胚层）分化模型 及调控 机制； （）多能干细胞向生 殖细

21、胞 分化模 型及调 控机制；（）表观遗传学 调控在 干细胞 定向分 化中的 作用 ；（ ）转 录及转 录后调控在 干细胞 定向分 化中的 作用 。图 2、各课题 间相互 关系课题、将建立和优化多能干细胞向三类组织细胞分化的培养体系（图 2）。课题 、不 仅为 课题 、 提供 分化 的细胞 模型 去研 究分 化过程中的分子 及表观 遗传学 调控， 同时也 有自己 在机制 研究上 的侧重 点。课 题 、侧重于 利用系 统生物 学方法 ，为课题 、的研究 提供机 制和提 出生物 学假设，使其在 分子水 平上得 到验证。并且，课 题、的 基 因敲入 和敲除 的小鼠模型将与 课题 、的荧 光报告 基因小

22、 鼠杂交 ，从个体发 育的角 度研 究表观 遗传调控如 何控制 动物体 内组织 器官的 形成 。并且 , 课 题、的研究 内容应 该是表 观遗传 调控路 线中 的上下游 的关系。课 题主 要集中 表观 遗传状 态是如 何建立 的，即在分 化过程 中细 胞特有 的调控因子 和表观 遗传酶 的相互 作用 ；而 课题 主要集 中在广 义的表 观遗传 调控机制，涉及 到对表 观遗传 状态的 解读 ，即表观遗 传状态 如何调 控基因 转录（转录组）。通过 对课题 、 研究结 果的整 合，我 们构建 出影响 干细胞 分化和 细胞谱系命 运的表 观遗传 调控网 络。课题 、 研究的 分化系 统之间 ，也存在

23、 信号分子、 RNA 结 合蛋白 、 microRNA 和 表观遗 传调控 机制上 的共同 点。通 过对不同分化 系统的 比较 ，我们才能 更好地 认识调 控机制 上的共 通性和 特异性 。我们希望通过操控向不同谱系分化的共通的关键调控机制，来提高定向分化效率；通过 操控不 同谱系 分化的 特异性 的关键 调控机 制，来 控制定 向分化 方向 。9欢迎下载精品文档因此，这四 个课题 形成有 机整体 ，对我们 综合认 识干细 胞在体 内、外及 不同模式动物中 的分化 机制是 缺一不 可的。4、工作安排本课题承 担单位 为清华 大学和 北京大 学和中 科院动 物所。具体 分工 和经费分配如下 :课

24、 题 1 ： 多能干细胞向体细胞（包括神经外胚层及心 血管中 胚层）分化模型及调控机制 ；负责人 :那洁,副教授 ,清华大学学术骨干 :沈沁，教 授，清 华大学张荣利，副教授 ,北京 大学预算经费 ：24%课 题 2 ： 多能干细胞向生 殖细胞 分化模 型及调 控机制 ；负责人 :韩春生 ,研究员 ,中科院动物所学术骨干 :纪家葵， 教授， 清华大 学预算经费 ：24%课 题 3： 表观遗传学调控 在干细 胞定向 分化中 的作用 ；负责人 :沈晓骅, 教授, 清华大学学术骨干 :刘晓玲， 高级工 程师， 清华大 学夏永静， 副教授 , 清华 大学预算经费 ：25%课 题 4 ： 转录及转录后调

25、 控在干 细胞定 向分化 中的作 用。负责人 :汤富酬,教授 ,北京大学学术骨干 :汪阳明， 教授， 北京大 学刘晓颖，讲师 ,北京大 学预算经费 ：27%那洁副教授和沈沁教授将分别负责多能干细胞向心血管和神经分化方面的研究。两实验室将合作建立转基因小鼠平台，分离体内发育的各阶段，各类型心血管和神经细胞。那洁副教授和张荣立副教授将合作在动物模型上验证分化细 胞的损 伤修复 功能 。 纪家 葵实验实 验室将 集中精 力于将 人的 ESCs 分化为 PGCs，而 韩春生实 验室将 集中力 量获得 从多能 性细胞 来的 SSCs。两 个研。10欢迎下载精品文档究组将合作建立从多能细胞到生殖细胞的更加

26、高效安全的诱导方案和机理研究。沈 晓骅教 授致力于系统解 析 PRC2介导的 表观遗 传学调 控在干 细胞定 向分化中的作 用，负 责多能干细胞系和knockin质粒的构 建，及 表观 调控网 络的构建。 刘 晓玲高 级工程师负责 建立和维持knockin小鼠，及 建立 转基因 小鼠平台，包括 拥有报告基因和双 标记基因敲入的小鼠模型或 microRNA 全 敲除的小鼠模型。夏永静副教授负责利用以上细胞和小鼠模型向心血管、神经和生殖分化方 面的研 究。汤富酬教授负责解析人和小鼠胚胎干细胞定向分化过程中的转录组及表观遗传组，及对关键转录因子的功能和它们与表观遗传因子和网络的相互调控。汪阳明教授负

27、责研究人和小鼠胚胎干细胞定向分化过程中 microRNA组学分析与其功能，及 microRNA 与表观遗传因子和网络的相互调控。以上科研工作者在课题分属的研究内容中均在国内外做出过突出的成绩，实验室均有良好的研究条件，包括硬件设施和软件支撑，能够保证课题的正常进行。科研成果形成论文将公开发表在知名杂志，关键技术将申报专利。5、创新点与特色（） 参加项 目的各个 课题组，近几年 来在 干细胞 研究方 面积累 了丰富 的研究经验和前期工作基础，在干细胞相关研究领域居国际领先地位。并且，本项目整合各实验室的特长，组织了干细胞基因调控研究方面的专家，包括表观遗传学（沈 晓骅 ）、表观遗传 和基因 组学

28、（汤 富酬 ）和非 编码 RNA（汪阳 明），与干细胞 信号传 导（那 洁）、神经 干细胞（沈 沁）和 生殖干 细胞（ 纪家葵， 韩春生）研究方面的专家。因此，我们是一支优势互补的团队。重要的是，我们会做到真正的交流、合作、互补与共同发展。我们将建立一个包括人和小鼠多能干细胞在体内、外向神经、心血管和生殖细胞分化的相关数据库。该库包括以 下几 个内容 ：分化 体系 ；全转 录组，包括 蛋白编 码基因 、 microRNA和长链 ncRNA 的表 达图 谱 ; 表观遗传 学图谱 ，包括H3K27me3、 H3K4me3 等标记图谱； 蛋白关 联网络 ，包 括 PRC2 的关联蛋 白；蛋白 RNA

29、 的关 联网络 ，包括 PRC2 的 关联 ncRNA 。各组在 自己的 研究系 统内开 展工作，不断更 新及共享数据库， 并探寻 其它 系统中 与自己 兴趣相 关的新 的突破 点。通 过统一 规划 ，联合攻关， 与定期 的学 术交流（ 比如每 月召 开一次 大组会 议），各 组之间 可以在第一时间内了解其它组的工作进展，从而避免了单枪匹马的孤军作战，增强我们在 国际竞 争中的 优势。（）本项目以发育生物学基本原理为基础，不仅从宏观系统水平上动态认。11欢迎下载精品文档识分化过程中的以表观遗传学为中心的调控网络，而且从分子水平上深入研究转录因 子、表 观遗传 学酶机 器、 microRNA 和

30、 长链 ncRNA 对多能 干细胞 定向分化的影响。从而了解细胞谱系在不同组织器官是如何被确立的，寻找影响定向分化的共同和特异机制，并着重于关键调控因子的鉴定。有的放矢地设计出提高 分化效 率和操 控细胞 命运的 最佳方 案。（）我 们已建 立了一 个非常成熟的 用生物 素和 FLAG 标记 PRC2 各核心组分的 ESCs 实验 手段。 利用 生物素（ biotin ）与 链霉亲 和素（ streptavidin）的高度特异 性及极 强的亲 和作用，结合 高通量 蛋白质 及 DNA 测序技 术，我 们有一个极好 的实验 平台去 揭示在全基因 组范围 内所有 与 PRC2 相互作 用的蛋 白、

31、microRNA 与长链 ncRNA 分子。并且， 通过构建 基因敲 入（ knockin)小鼠模型，将生物素 FLAG 双标记 通过同源重组 整合到 内源编 码 PRC2 组分 的基因 组位点上，为研 究在动 物体 内表观遗传机 制对胚 胎发育、 器官形 成提 供实验 平台 。（）单细胞分析是本项目的特色之一。由于分化、发育过程中细胞的异质性（ Heterogeneity）， 单纯的 大量细 胞平均 分析（ Ensemble Analysis）会损失关键的基因表达调控信息。在本课题中，我们将利用我们自己最近发展的单细胞数 字转 录组分 析技术 （ RNA-Seq ），对多 能干 细胞在 体内

32、、 外原 初分化过程中的基因表达变化进行单细胞分辨率的、全转录组范围的分析，获得基因表达调控网络的精确定量信息。同时，我们正在建立及完善少量细胞 ChIP-Seq 和 RIP-Seq 技术。将单细 胞转录 组分 析与表 观遗传 组分析 结合起 来，我们将突破简单的基因表达现象描述以及简单的表观遗传组现象描述，利用最新的技术手段，研究多能性细胞分化发育过程中关键表观遗传密码对于核心基因表 达网络 的调控 机理。（）我 们已建 立可microRNA全敲除的ESCs 和小鼠 模型， 为寻找在干细胞分化过程 中起关 键作用 的 microRNA提供了实验基础 和手段。 这一模 型避免 了因microR

33、NA表 达的 饱和性 （ saturation）和 冗余 性（ redundancy） 对研究microRNA 功能所 造成的 技术性 困难 。本项 目侧 重于研 究 microRNA 与表观遗 传因子之间的相互调控这一尚未充分研究的领域，以此作为一个突破口来探讨表观遗传 修饰建 立的机 制，并且为 完善ESCs 的定向分 化提供 新的靶点和技 术。（）我 们是世 界上率 先使 用RNA 转染技术 进行细 胞重编 程的团 队之一 ，在这项新技 术的应 用上已 积累了 很多经 验。相比DNA，病毒或 蛋白质的技术， RNA技术有简单直接，高效可控，不改变基因组等优点，这决定了它在细胞治疗。12欢

34、迎下载精品文档和再生医 学中将 会有广 泛应用 。本研 究进一 步开发RNA 转 染技术 在干细 胞定向分化中 的应用 ，以提 高分化 细胞生 成效率 和安全 性。6、可行性分析研究如何诱导多能干细胞分化为具有独特功能的各种成体细胞是国际干细胞和再生医学领域的研究热点，但也是研究难点。尽管科学家们已投入了大量的精力去尝试各种生长因子和细胞因子的组合培养体系使多能干细胞在体外特定条件下分化为各种类型的细胞，但是分化方向很难控制，分化效率低，并且所得到的细胞往往缺乏正常的生理功能。因此，这一问题的解决依赖于对干细胞在定向分化过程中的调控机制的全面深入解析。个体发育和干细胞分化过程的本质就是在不同类

35、型的细胞中建立不同的表观遗传图谱。因此，系统解析以表观遗传学图谱的建立、维持、识别和解读机制为中心的分子调控网络，是认识干细胞分化和个体发育的关键所在，也是最有可能产生突破性发 现的研 究方向 。近几年来，本项目 的主要 参加人 员在 多能干细 胞的表 观遗传 机制（沈 晓骅）、转录和转录后调控（汤富酬、汪阳明），与多能干细胞的定向分化（沈沁、那洁、纪家葵、韩春生）方面做了大量扎实的工作，已经积累了丰富的实验经验和大量前期实验结果，并获得了多项具有国际影响的研究成果。在此基础上，我们将研究进一步集中在以表观遗传调控为中心的分子调控网络这个方向上，使用最前沿的科学技术手段，综合运用各种生物学和系

36、统生物学技术，对体外和体内干细胞分化过程展开系统、深入的分析，因此取得重大突破性成果的可能性是很高的。这样实质性的合作研究是单个研究体系、单个实验 室所难 以企及 的。13欢迎下载精品文档四、年度计划第一年研究计划1、运用不同的生长因子和信号分子组合，定向诱导多能干细胞向心血管、神经和生殖细胞分化，建立和优化分化培养体系；2、制作一系列转基因细胞系，带有心血管、神经或生殖细胞组织特异性报告基因（比如 Mesp1、 Nkx2.5 、 Islet1 、 Six3 、 Pax6、 VASA和 Dazl 驱动表达的荧光标记） ，纯化不同分化阶段的心血管、神经及生殖细胞；3、利用组织细胞特异性 CRE小

37、鼠（如 Mesp1-CRE、 Mef2C-CRE、 MHCa-CRE、 Pax6-CRE、TH-CRE等）与双色荧光 Flox 转基因小鼠杂交，分离体内发育的各阶段不同类别的心血管、神经及生殖细胞；4、分离小鼠早期胚胎发育过程中的上胚层、外胚层、中胚层和内胚层细胞，优化单细胞高通量测序技术（ single-cell RNA-Seq），对以上分离纯化的、体内外各组织类型细胞，进行单 / 多细胞 cDNA和microRNA文库的构建；5、建立人和小鼠 ESCs系稳定表达生物素（ biotin ）和 FLAG双标记的表观调控蛋白（比如PRC2复合体组分包括 EED、 EZH2、EZH1、 JMJ 和

38、 MTF2）；建立生物素（ biotin ）和FLAG双标记基因敲入（ knockin ）的 ESCs。预期目标1、 建立人和小鼠多能干细胞向心血管、神经和生殖细胞的分化、分离和培养系统；2、 建立若干组织特异性荧光蛋白报告体系；3、 获得较为纯化的心血管前体和组织细胞、神经干细胞（ NSCs）、神经元、原始生殖细胞（ PGCs）和精原干细胞（ SSCs）和小鼠体内分离的各胚层细胞；4、 完成 RNA-seq 和 microRNA-seq 测序文库的构建；5、 完成基因组敲入（knock-in ）质粒载体的构建，并得到内源编码bfPRC2 组分的阳性克隆 ESCs；建立表达bfPRC2 的分化

39、细胞系，包括EpiSCs ( 上胚层干细胞，仅对小鼠 ) 、NPCs（神经前体细胞）和NSCs （神经干细胞）等。14欢迎下载精品文档第二年研究计划1、对体内外分化的各阶段、组织的细胞进行RNA-seq和 microRNA-seq 分析，研究编码及非编码基因表达谱；筛选多能干细胞向各组织定向分化的差异表达基因和非编码RNA；2、对体内外分化的各阶段、组织的细胞进行染色质免疫沉淀- 测序（ChIP-seq ）分析，系统解析定向分化各阶段细胞的H3K4me3和 H3K27me3等表观遗传修饰谱式;3、建立体外分化的人类神经干细胞和血管内皮细胞的共培养体系；鉴定 microRNA 缺失干细胞在分化过

40、程中的表型；构建生物素FLAG双标记 PRC2的小鼠模型；建立生殖系统小鼠动物模型研究平台；4、优化 biotin-streptavidin介导的蛋白提纯及质谱鉴定，和RNA免疫沉淀及高通量测序 (bioRIP-seq)的实验方法；鉴定与 PRC2相互作用染色质区域； 研究 -catenin在多能干细胞心血管组织分化过程中的结合蛋白；分析Foxg1 和 Jarid1B在多能干细胞分化过程中各时期的表达特性；通过 RNAi 和过表达研究Foxg1 在神经外胚层和前脑神经元分化中的作用；研究生殖质的功能。预期目标1、 解析未分化和不同分化细胞的全基因组表达谱，初步建成多能干细胞向心血管、神经和生殖

41、细胞定向分化的基因表达调控网络，筛选若干在神经、心血管和生殖细胞分化过程中可能起重要作用的、 差异表达的转录因子、 表观遗传调控蛋白、 microRNA 和长链 ncRNA；2、 鉴定 PRC2和 H3K4me3、 H3K27me3等表观遗传修饰在染色质上的结合区域；3、 完善蛋白组学和 bioRIP-seq 的实验方法，为后期大规模系统生物学研究提供最佳实验手段；4、 深入揭示经典信号通包括 Wnt/ -catenin 等、 Foxg1 和表观遗传调控因子（ PRC2、BAF250a、BAF180、ZFP261）等在神经、心血管和生殖细胞分化中的分子与表观遗传学调控机制；鉴定microRNA

42、 缺失的干细胞和神经- 心血管共培养体系中的干性基因。15欢迎下载精品文档表达、分子标记物和生理特征；5、 完成若干小鼠动物模型的构建，获得内源启动子驱动表达生物素-FLAG 标记PRC2基因的敲入小鼠，获得几个可能对生殖细胞形成起重要作用的基因的flox条件性敲除小鼠，包括BAF250、BAF180、ZFP261 和 Stra8-EGFP， TNAP-CRE、 VASA-CRE、Stra8-CRE 、Ngn3-CRE等转基因小鼠。第三年研究计划1、对于差异表达的 microRNA、ncRNA和蛋白因子 , 利用 RNA过表达、 RNAi、反义核酸以及基因敲除、 免疫共沉淀和 ChIP 等技术

43、，深入研究它们在多能干细胞向心血管、 神经和生殖细胞定向分化的功能；2、研究 Musashi 、HuD、 FMRP、PELOTA、DAZL和 VASA等 RNA结合蛋白在多能干细胞定向分化中的功能；3、利用蛋白质复合体纯化和质谱测序系统高通量筛选多能干细胞定向分化中与PCR2相互作用的蛋白质, ；4、利用 bioRIP-seq高通量筛选多能干细胞定向分化中与PCR2相互作用的非编码RNA（ncRNA）；5、利用 microRNA 缺失干细胞及相关分化表型筛选起重要调控作用的microRNA，并研究 microRNA 和转录因子对于表观遗传修饰的直接调节机制;6、建立同时拥有报告基因和双标记表观遗传基因敲入的小鼠模型或microRNA 全敲除的小鼠模型；建立小鼠心肌梗死、神经细胞和生殖细胞移植模型。预期目标1、构建与 PRC2相互作用的蛋白调控网络和RNA调控网络（ ncRNA和 mic