基因克隆步骤完整版

1、精品1总 RNA 提取(1)液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol 加到离心管中待用(2)将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min ；打开离心机预冷(3) 加 200 L氯仿，振荡 15 sec ，室温放置 3 min ，分层；(4) 4 o C，12,000 g，离心 15 min ；(5) 取上清，加 500 L异丙醇，混匀，室温放置 10 min ；(6) 4 o C，12,000 g，离心 10 min ；(7) 弃上清，加 1 mL75% 乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100% 乙醇清洗(8) 4 o C，7,500 g ，离心 5 min ；(9) 弃上

2、清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后， 加 50 LDEPC水， 80 o C 保存。此操作中所用到的器皿均需经过DEPC 灭活 RNA 酶处理。提取的总RNA需经 RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD 260 值为核酸的吸收值，OD 280 值为蛋白的吸收值， OD 260/280 值在 1.8-2.0 间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内， 可正常使用；此外还有 OD 230 值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD 260/230 值能达到 2.2 左右。 RNA 浓度计算公式： 总 RNA 浓度（g/mL）=A 260 ×稀释倍数×4

3、0 。-可编辑-精品2 反转录 /cDNA第一链的合成纯化 RNA 以去除基因组DNA ，操作按 TaKaRa 公司的 PrimeScriptRTreagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为：Total RNA1 g5× gDNA Eraser Buffer2 LgDNA Eraser1 LRNase Free dH 2 O补齐至 10 L条件为： 42 o C，2min ；RNA 纯化后，即可进行反转录。其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（ for Real Time ）4LPrimeScr

4、ipt RT enzyme mix1 LRT Primer Mix1 L上一步的反应液10 LRNase Free dH 2 O补齐至 20 L操作条件为：(1) 37 oC 放置 15 min ； (2) 85 o C， 5 sec ； (3) 4 o C 保存。3 PCR按 TaKaRa 公司的 Premix Taq Version 2.0 操作， PCR 反应体系如下：-可编辑-精品Premix Taq25 L模板5 L引物 1 (10M)1L引物 2 (10M)1LddH 2O18 LPCR 反应条件为： 94 °C预变性 5min ；94 °C变性 30s ， 5

5、3 °C退火 30s ，72 °C延伸 30s ，循环 36 次； 72 °C延伸 10min 。PCR 反应完毕，取5L反应产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用 10 L反应产物）。4 基因克隆及测序4.1PCR 产物切胶回收将 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的 DNA 片段。使用 TIANGEN 公司的 Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下：(1) 平衡吸附柱： 向吸附柱 CB2 中（吸附柱放入收集管中） 加入 500 L平衡液 BL， 13,400 

6、15;g 离心 1 min ，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2 重新套回收集管中；(2) 按 100 mg agarose 胶加入 100 L溶液 PC，置于 50 o C 中 10 min 左右，中途混匀几次，至胶完全融化；(3) 将样品倒入一个吸附柱 CB2 中（吸附柱放入收集管中） ，室温下 13,400×g 离心 1 min ，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2 重新套回收集管中；-可编辑-精品(4) 向吸附柱 CB2 中加入 600 L漂洗液 PW （加乙醇），室温下 13,400 ×g离心 1 min ，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2 重新套回收集管中；(5)

7、重复上一步骤；(6) 将吸附柱 CB2 放入收集管中，室温下 13,400 ×g 离心 2 min ，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(7) 将柱子套入一新的灭菌 1.5 mL 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50 L 洗脱缓冲液，室温放置2 分钟， 13,400 ×g 室温离心 2 min ，收集到的洗脱液即为回收的DNA 纯化液；(8) 取 5L 的纯化液体进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中 DNA 含量。4.2 目的片段与载体连接(1) 胶回收产物与 T 载体连接体系，参考 Takara 公司 pMD18-T 载体的试剂盒说明

8、书。在灭菌的 0.5 mL 离心管中配制如下溶液（ 10 L：）回收 DNA4 LLigation Solution5 LpMD18-T Vector1 L(2) 16 oC 反应 30 分钟，所得产物保存于 4 o C 冰箱备用。4.3 连接产物转化 E.coli DH5(1) 将 5 L 连接产物加入到 100 LE.coli DH5 感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置 30 min ；(2) 42 oC 水浴热激转化 90 sec ，立即放回冰上，放置 3 min ；-可编辑-精品(3) 每管加入 500 L LB 培养基（室温放置）， 37 o C 160-180 rpm振荡培养 45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；(4) 在含有 Amp （ 100 g/mL）的选择性平板上加入60-100 L 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；(5) 将培养皿正放， 37 o C 约 50 min ，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养 10-16 h 。4.4 转化子的筛选及鉴定(1) 用无菌枪头挑取 LB 平板上 3-5 个单菌落，分别接种到 3.5 mL LB 液体培养基中（含 100 g/mL Amp ）， 37 o C，16