第7章原生质体培养和体细胞杂交

1、植物组织培养植物组织培养Good Morning第第7 7章章 原生质体培养与原生质体培养与 体细胞杂交体细胞杂交原生质体的分离与纯化原生质体的分离与纯化原生质体培养原生质体培养原生质体融合原生质体融合第第7章章 原生质体培养原生质体培养 与和体细胞杂交与和体细胞杂交本章主要内容本章主要内容(3(3学时学时) )l(1)了解原生质体培养的意义；了解原生质体培养的意义；l(2)掌握原生质体分离的大致步骤；掌握原生质体分离的大致步骤；l (3)掌握原生质体培养的方法；掌握原生质体培养的方法；l(4)掌握原生质体融合的方凑。掌握原生质体融合的方凑。 第第7章章 原生质体培养原生质体培养 与和体细胞杂

2、交与和体细胞杂交本章教学目的与要求本章教学目的与要求 原生质体（原生质体（Protoplast）l含义：含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。具有生活力的裸露细胞。第第7章章 原生质体培养原生质体培养 与和体细胞杂交与和体细胞杂交微微 丝丝叶绿体叶绿体线粒体线粒体质质 膜膜细胞核细胞核内质网内质网微微 管管细胞壁细胞壁高尔基体高尔基体第第7章章 原生质体培养原生质体培养 与和体细胞杂交与和体细胞杂交液液 泡泡第一节、原生质体分离及纯化第一节、原生质体分离及纯化l一、原生质体分离原生质体分离双子叶外植体双子叶外植体胚性细胞胚性细胞第第7章章 原生质体培养原生

3、质体培养 与和体细胞杂交与和体细胞杂交l多数植物分离原生质体的经典材料多数植物分离原生质体的经典材料-叶肉细胞。叶肉细胞。第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化（一）材料来源（一）材料来源l禾本科植物：禾本科植物： 愈伤组织或悬浮细胞。愈伤组织或悬浮细胞。第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化（二）（二） 分离方法分离方法机械分离法机械分离法酶法分离法酶法分离法1、机械分离法（、机械分离法（Machanical isolation）第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化优点：优点：（1）能排除酶的有害影响能排除酶的有害影响；缺点：缺点：（1）原生

4、质体的产量低；原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；）方法繁琐费力；（3）局限性大）局限性大（1 1）酶的种类）酶的种类l纤维素酶类（纤维素酶类（CellulaseCellulase） l果胶酶类（果胶酶类（PectolyasePectolyase）l半纤维素酶类（半纤维素酶类（HemicellulaseHemicellulase）l崩溃酶崩溃酶l蜗牛酶蜗牛酶2、酶法分离（酶法分离（Enzymatic isolation）第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化（2）酶液的配制第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化渗透压稳定剂渗透压稳定剂及及pH酶的配比及浓酶的配

5、比及浓度度（3 3）分离原生质体）分离原生质体第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化两步分离法两步分离法一步分离法一步分离法方法有二：方法有二：叶肉原生质体分离提纯叶肉原生质体分离提纯图示原生质体分离过程（以叶片为例）图示原生质体分离过程（以叶片为例）第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化过滤、离心过滤、离心加果胶酶加果胶酶和纤维素酶和纤维素酶第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化叶片叶片愈伤组织愈伤组织二、二、 原生质体纯化与活力测定原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化（一）原生质体纯化第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化

6、方法三种方法三种离心沉淀法离心沉淀法漂浮法漂浮法界面法界面法1、 离心沉淀法离心沉淀法l原理原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。生质体沉于底部。l步骤步骤：l第一步原生质体溶液用第一步原生质体溶液用400400目网筛过滤。目网筛过滤。l第二步离心（第二步离心（500-1000r/min500-1000r/min，离心，离心5-6min5-6min）。）。l第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此淀。如此2-32-3次。次。l第四步用原生质体培养液洗第四步用原生质体培养液洗1 1次，收

7、集原生质体。次，收集原生质体。第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化2、漂浮法、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。漂浮在液体的表面。l步骤步骤：l第一步：第一步：400400目网筛过滤。目网筛过滤。l第二步：离心。第二步：离心。l第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-32-3次。次。l第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1 1次。次。第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化 3 、 界面法界面法25

8、%蔗糖溶液蔗糖溶液13%甘露醇溶液甘露醇溶液原理：原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。另一种溶液小于原生质体的密度。第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化（二）（二） 原生质体活力测定原生质体活力测定1、形态识别：、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2、染色识别、染色识别l1 1）0.1%0.1%酚番红或酚番红或EvansEvans蓝染色：有活力

9、的不被蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。染色，死亡的被染上色。l2 2）双醋酸盐荧光素）双醋酸盐荧光素(FDA)(FDA)染色法：在荧光显微染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。镜下有荧光的即为有活性的原生质体。第一节、原生质体分离第一节、原生质体分离 及纯化及纯化第二节第二节 原生质体培养原生质体培养一、培养基一、培养基pH渗透压渗透压钙镁钙镁生长物质生长物质氮源氮源碳源碳源培养基培养基第第7章章 原生质体培养原生质体培养 与和体细胞杂交与和体细胞杂交二、培养方法二、培养方法培养方法培养方法液体浅层培养液体浅层培养平板培养法平板培养法双层培养法双层培养法饲养层培养法饲养

10、层培养法第二节、原生质体培养第二节、原生质体培养1 1、液体浅层培养、液体浅层培养第二节、原生质体培养第二节、原生质体培养原生质体原生质体悬浮液悬浮液1mm厚液体培养基厚液体培养基2x105/ml2、平板培养、平板培养 原生质体纯化、离心、稀释后，再与原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（琼脂或琼脂糖（3737 C C左右）等体积混合成左右）等体积混合成0.7% 0.7% ，培养于培养皿中。培养于培养皿中。第二节、原生质体培养第二节、原生质体培养3、双层培养法（固、液培养）、双层培养法（固、液培养） 培养皿底部铺一层培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固琼脂糖的固体培养基，在其上进

11、行原生质体浅层培体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。养。第二节、原生质体培养第二节、原生质体培养固体培养基固体培养基4、饲养层培养、饲养层培养方法一：方法一：X-X-射线杀死原生质体，与生活射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入力正常的原生质体混合，加入0.7%0.7%琼脂，琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。制成混合液，培养于培养皿中。第二节、原生质体培养第二节、原生质体培养方法二：方法二：X-X-射线杀死原生质体，与射线杀死原生质体，与0.7%0.7%琼琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与层，再将生活力正常的原

12、生质体与0.7%0.7%琼琼脂混合，培养于饲养层上。脂混合，培养于饲养层上。4、饲养层培养、饲养层培养第二节、原生质体培养第二节、原生质体培养第一次分裂第一次分裂第二次分裂第二次分裂第三次分裂第三次分裂多细胞团多细胞团第二节、原生质体培养第二节、原生质体培养原生质体的分裂原生质体的分裂肉眼可见细胞团肉眼可见细胞团愈伤组织愈伤组织器官发生途径器官发生途径胚胎发生途径胚胎发生途径植株植株第二节、原生质体培养第二节、原生质体培养植株再生途径植株再生途径定义：定义：原生质体融合原生质体融合也叫做也叫做体细胞杂交体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条

13、件下，相互融合成一体，形成杂工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。第第7章章 原生质体培养原生质体培养 与和体细胞杂交与和体细胞杂交第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合一、原生质体融合意义一、原生质体融合意义克服杂交不亲合克服杂交不亲合克服生殖器官败育克服生殖器官败育克服柑桔多胚克服柑桔多胚第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合番茄+马铃薯第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合二、融合方法 无机盐诱导融合无机盐诱导融合 高高pH-高高Ca离子离子 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)法法 PEG结合高钙结合高钙-高高pH诱

14、导法诱导法 电融合技术电融合技术第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合(一一)无机盐诱导融合无机盐诱导融合: NaNO3法法l1972年：年： Carlson诱导原生质体融合获得诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。杂种。NaNO3的作用：的作用：中和质膜的负电荷，使原中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。不足：诱导频率不高。第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合 19731973年：年：KellerKeller用用pH10.5pH10.5的的50 mM

15、CaCl50 mM CaCl2 2溶溶液在液在3737时，诱发烟草叶肉原时，诱发烟草叶肉原生质体融合。生质体融合。优点：杂种产量高。优点：杂种产量高。不足：高不足：高pHpH值对细胞有毒害作用。值对细胞有毒害作用。第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合（二）高（二）高pH-高高Ca离子法离子法PEG法法特点：特点：融合频率高融合频率高可重复性强可重复性强诱发融合无特异性诱发融合无特异性毒性较低毒性较低植物植物+ +植物植物植物植物+ +动物动物动物动物+ +酵母酵母Polyethylene Glycol（聚乙二醇）（聚乙二醇）第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合（三）（三）PEG法法PE

16、G法法原理原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。连而导致融合。第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合PEGPEG法法示意图示意图第三节、原生质体融合第

17、三节、原生质体融合-+-桥梁桥梁+-PEG被洗掉被洗掉+-+-电荷重排电荷重排+-+-+-+-膜接触膜接触l最为常用。最为常用。l具体做法具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质：在无菌条件下混合双亲原生质体体-滴加滴加PEGPEG溶液，摇匀，静置溶液，摇匀，静置-滴加滴加高钙高钙- -高高pHpH溶液，摇匀，静置溶液，摇匀，静置-滴加原生滴加原生质体培养液洗涤数次质体培养液洗涤数次-离心获得原生质离心获得原生质体细胞团体细胞团-筛选筛选-再生杂合细胞再生杂合细胞第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合（四）（四）PEG结合高钙结合高钙-高高pH诱导法诱导法(五五)电融合技术电融合技术Senda

18、1979年首先用此方法实现原生年首先用此方法实现原生质体融合质体融合细胞融合仪细胞融合仪第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合电融合法原理电融合法原理 交流电场使原生质体表面电荷偶极交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。化，沿着电极排列，形成串珠。+-负极负极正极正极+-+-+-+-第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合+-+-+-+-施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合+-+-+-+-+-+-+-+-原生质体的融合

19、过程：原生质体的融合过程：第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1 1互补选择法互补选择法第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合2、机械分离杂种细胞法、机械分离杂种细胞法3. 双荧光标记选择法双荧光标记选择法异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色）：绿色异硫氰酸罗丹明（异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色）：红色3. 3. 双荧光标记选择法双荧光标记选择法第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合四、体细胞杂种植株的鉴定四、体细胞杂种植株的鉴定 形态学鉴定形态学鉴定 细胞学观察细胞学观察 D

20、NA内切图谱分析内切图谱分析 同工酶分析同工酶分析第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合4-1、形态学鉴定、形态学鉴定第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合4-2、细胞学观察、细胞学观察染色体形态和数目的比较染色体形态和数目的比较18条染色体条染色体36条染色体条染色体第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合4-3、 DNA内切图谱分析内切图谱分析RAPD带型带型（随机扩增的多态性（随机扩增的多态性DNA）第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合l(1) 原生质体培养的意义：原生质体培养的意义：(1)再生植株；再生植株； (2)用于远缘用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。体细胞融合，进行体细胞杂交。l(2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 l(3)酶的种类及特点酶的种类及特点l(4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面