11.2-Trizol法提取RNA及检测(汇总整理)

1、目录植物总RNA的提取（TRIzol法）及检测2MOPS Buffer配方:6甲醛变性电泳7植物总RNA的提取（TRIzol法）及检测一、实验目的与原理简介TRIzol法提取植物（如韭莲）总RNA，可用于Northern blotting、mRNA分离、cDNA的反转录及RT-PCR等。RNA的质量是本实验研究中最基本，也是最为关键的步骤之一。为了获得完整、丰富的全长cDNA，关键是获得完整的、未被降解和最大量的RNA。RNA的质量决定着可被反转录为cDNA最大的序列信息。因此，获得最优质的RNA及避免引入RNA酶和反转录酶抑制剂（如SDS，EDTA）是十分重要的。从植物中提取RNA与DNA的

2、方法大致相同，但是，RNase不易失活，在常规的高压灭菌中无法使其失去活力，且空气中、人的手上及唾液中都含有丰富的RNase，所以在分离RNA时应该采取有效的措施，抑制和避免RNase的污染；所有试剂应该用0.1%DEPC(即焦碳酸二乙酯，下同)处理或用0.1% DEPC处理过的水配置，37过夜，高压灭菌20min。本实验采用TRIzol试剂法，此方法是异硫氰酸胍法的改进，可从103个细胞或毫克级的组织中有效提取RNA，如果操作得当，获得的RNA会比较完整而未降解，且不含蛋白和DNA的污染。二、准备工作（试剂配置和器材准备）实验所用的研臼，杵，小药勺，试剂瓶，量筒，剪刀等与实验材料有接触的器皿

3、都要在0.1%的DEPC水中浸泡24h，用锡纸包裹于180（烘箱）高温灭菌2h或160高温灭菌4h后备用；塑料制品如进口tip头、eppendorf管(1.5ml，0.5ml)高压灭菌，烘干后备用(放置时间不宜超过一周)。RNase-free water的制备如下：在蒸馏水中加入0.1%体积的DEPC原液（如1000ml蒸馏水中加1mlDEPC原液）， 用塑料膜封口后，充分混匀，静置过夜，高压灭菌.(注意:DEPC有强诱癌作用，操作时须谨慎，加了DEPC的水放通风橱中，避免吸入气体)三、实验操作步骤1）称取0.5g植物材料，用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，分装于两个1.5ml的eppendorf

4、离心管中注意：动作尽量迅速，避免RNA降解；另外，要尽量地选用幼嫩的植物材料，因其RNA的含量相对于老材料要丰富。2）加入1ml TRIzol，用力摇动使混合均匀，室温下放置5min（混合液呈棕红色，可分成三大层：上层水相中含有RNA，中层含蛋白和下层有机相为材料残渣及DNA等）注意：样品的量不要超过TRIzol体积的10%，过多反而会降低RNA的得率。3）（此步可根据实际情况选择做还是不做）当样品中蛋白、脂肪及多糖含量较高时，离心（4，12，000g，10min）， 小心将上清液吸入1.5ml的eppendorf离心管中注意：RNA的抽提过程中的所有离心操作皆在4的冷冻离心机上进行（下同）4

5、）每管加0.2ml氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min，离心(4， 12，000g，15min)5）将上清液(约600ul)吸入1.5ml的新eppendorf离心管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀（动作要缓和），-20冰箱中放置30min（过夜则沉淀更加充分）6）离心（4，12，000g，15min）7）弃上清，收集RNA沉淀，加1ml 75%乙醇洗涤沉淀1-2次（离心4，12000g，10-15min，弃上清，收集RNA沉淀）注意：75%乙醇为无水乙醇和DEPC处理过的蒸馏水所配制8）沉淀室温下干燥15-20min注意：不应该完全干燥失水，否则RNA沉淀很难溶解9）溶于适量

6、(30-50ul)RNase-free water中10）（此步可根据实际情况选择做还是不做）若该种植物含有较多多糖，则需在60水浴中温浴5min， 离心（4，12，000g，10min）吸取上清备用，此即为所需的RNA液11）储存在-70的超低温冰箱中备用四、质量检测与结果分析RNA检测采用甲醛变性电泳法和紫外吸收法相结合的办法，RNA电泳液为1×MOPS(1) 配制1%琼脂糖变性胶DEPC处理过的水46.5ml甲醛(37%，pH>3.5)3.0ml10×MOPS5.5ml琼脂糖0.55g总体积55ml注意: 制胶时先将水，MOPS，琼脂糖熔化（可用微波炉），室温放

7、置至冷却到60，再加入甲醛（剧毒，操作小心），混匀并置通风橱中，稍稍冷却后倒入制胶器中。（2）RNA电泳点样液体系(每一离心管中)5×MOPS2ul去离子甲酰胺10ul甲醛3.5ulRNA4.5ul总体积20ul65，水浴10min，再加少量EB和溴酚蓝混匀后点样， 电泳（80V），电泳1-2h左右，紫外检测中若能看到两条清晰可区分的主带（28S和18S）的RNA，则表明RNA完整无降解。一般认为28S和18S真核细胞RNA比值约为2：1（从电泳的两条主带的亮度可判断）。如该比值逆转，则表明有RNA降解，因为28SRNA可特征地降解为类似18S的RNA，在电泳图象上表现为只有一条主带

8、或出现弥散等现象。（3）测OD值分光光度计 预热15min 设置参数 RNase-free 水调零 测OD值取2ulRNA加到1998ulRNase-free water(稀释100倍)中，用分光光度计（如NanoDrop，Nanoplus等）测OD260nm和OD280nm，并计算它们的比值，来分析RNA的纯度。比值若为2.0，这是一个理想值，表明无杂质的污染，我们在实验中要求比值必须达到1.85-2.0之间为佳。若低于1.7则可能是由于蛋白污染所致，若高于2.0则可能是由于含有其他一些药剂的残留所致。总RNA(ug)=OD260nm×40ug/ml×1000（

9、稀释倍数）×总RNA溶液体积(ul) /1000五、实验总结（注意事项）由于RNA极易被RNA酶降解，加上RNA酶非常稳定而且广泛存在（如玻璃制品、塑料制品、电泳槽及手和唾液等），因此在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。本实验中主要采取下列措施：(1)所有玻璃器皿使用前均须在180度的烘箱中烘烤3h以上，塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿洗涤；(2)RNA电泳槽，须先用去污剂洗涤后，用水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于3% H2O2溶液中，室温下放置10min，然后用0.1%DEPC水彻底冲洗，晾干备用；(3) RNA实验所用的设备应专门准备一套，例如移液枪、枪

10、头盒和电泳槽等可贴上RNA专用的标志；(4)实验过程中勤换一次性手套；(5)为避免RNA酶的污染，提取RNA的所有试剂和用具物品必须是专用的，必须小心操作，保证试剂药品如TRIzol，氯仿和异丙醇等不被污染；(6)提取前可先用无水乙醇或氯仿对通风橱中的操作桌面进行清理工作，再将待用的物品如移液枪、枪头盒及离心管架等放置好；(7)在RNA的提取过程忌讲话谈论，忌人员走来走去；(8)DEPC和甲醛等剧毒物品，应小心按有关的实验规定进行操作和处理。MOPS Buffer配方:即3-吗啉丙磺酸缓冲液，可作为二维凝胶电泳中等电聚焦电泳（IEF）的电解质系统成分；还可应用于Northern杂交，作为RNA

11、的分离和转膜时的缓冲液。组份浓度：200 mM MOPS, 20 mM NaOAc, 10 mM EDTA10×MOPS Buffer配制方法（1 L）：1. 称量41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。2. 加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。3. 使用2 N NaOH 调节pH值至7.0。4. 再向溶液中加入下列试剂：1M NaOAc(DEPC处理)：20ml0.5M EDTA(pH8.0)(DEPC处理)： 20ml5. 用DEPC 处理水将溶液定容至1 L。6. 用0.45 m 滤膜过滤除去杂质。7. 室温避光保存。注意事项： 溶液见光或高温灭菌后会变黄。

12、变黄时也可使用，但变黑时不要使用。甲醛变性电泳一、实验原理提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。将RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来，通过加入标准核酸分子（markers）对其进行鉴定，并用于转膜、杂交等。二、实验试剂1）DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水2L，在通风橱中，加入2ml DEPC到2L去离子水中，终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子，混匀，然后放在摇床中中速摇荡至少4hr，再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开，15磅灭菌20min。2）10&#

13、215;MOPS缓冲液（即10×FA缓冲液）： 药品终浓度MOPS（3-N-吗啉丙磺酸0.2mol/LNaAc 80mmol/LEDTANa2 10mmol/L先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS和4.1gNaAc后，加入10ml 0.5mol/L EDTA，定容500ml。用0.22mm滤器过滤除菌，装入棕色瓶中，室温避光保存。或药品终浓度MOPS（3-N-吗啉丙磺酸0.2mol/LNaAc 50mmol/LEDTA10mmol/L用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，临用时用DEPC水稀释。3）1×MOPS电泳缓冲液（即1

14、×甲醛变性胶电泳缓冲液1×running buffer）：10×MOPS 150ml 37%甲醛80ml加水至1500ml一般在3次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。 4）5 × 甲醛变性胶加样缓冲液（5×loading buffer）：预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝，加入1ml DEPC水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在15ml灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：10 × FA buffer4.0ml 

15、;甲酰胺3.1ml100%的甘油2.0ml37%的甲醛720ul0.5MEDTA （PH 8.0）80ul 水饱和的溴酚蓝16ulDEPC水100ul 总体积10ml混匀，分装，-20保存，常用放4保存。 或 甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液（10×）：甘油 505mlEDTA1mmol/L20ul溴酚蓝0.2525mg二甲苯氰0.2525mg加DEPC水至10ml，高压后，4°C保存。三、实验设备1. 电泳设备2. 紫外灯四、实验步骤1电泳槽用0.3%H2O2浸泡30min，DEPC水冲洗晾干；2铺胶（40ml） 琼脂糖0

16、.55g DEPC水 36ml10×MOPS   5ml37%甲醛 9ml 称0.55克琼脂糖加36ml DEPC水，微波炉加热溶解琼脂糖，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至50-60，加9ml 甲醛（37%）和5ml 10×电泳缓冲液，然后灌制凝胶，插入合适长度和宽度的梳子，于室温放置30分钟以上使凝胶凝固；3RNA样品处理（以一条泳道为例）一般取0.3 g的总RNA，加入1/5体积的5×加样缓冲液，65加热5 min，冰上骤冷，以消除RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭（EB，浓度1.0 mg/mL），而不在胶中加EB，这样电泳后的背景较低。配好的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15min。RNA样品在5-10 V/cm的电压降下电泳30min；4加2.0ml甲醛凝胶加样缓冲液（10×） ；5加样和电泳：将凝胶预电泳15min，电压降为5-10 v/cm。随后加样品和标准物，以3-4v/cm电压降电泳，电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处；6电泳结束后，在紫外灯下，仔