氨基酸的分析分离 为了测定蛋白质中氨基酸的含量、组成或从蛋

1、 氨基酸的分析分离 为了测定蛋白质中氨基酸的含量、组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸，都需要对氨基酸混合物进行分析和分离工作。其方法较多，而目前使用较多的是层析法。（1）分配层析的一般原理：所有的层析系统都有两个相组成，一个为固定相或静相（stationary phase），一个为流动相或动相（mobile phase）。混合物在两相中的分离决定于混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数（ partition or distribution coefficient）来描述：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中进行分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd

2、）。用下式表示： CA 表示某一物质在动相中的浓度 Kd= CB 表示某一物质在静相中的浓度 物质分配不仅可以在互不相溶的两种溶剂即液相-液相系统中进行，也可在固相-液相或气相-液相间发生。其系统中的静相可以是固相、液相或固-液混合相（半液体相）；动相可以是液相或气相，它充满于静相的空隙中，并能流过静相。 在实际层析时，其层析行为一般并不直接决定于它的分配系数，而是取决于有效分配系数Keffo： 某一物质在A相中的总量 Keffo= 某一物质在B相中的总量对液相-液相层析系统来说： CAVA Keffo = = KdRV CBVB这里，CA和CB的意义同前；VA和VB分别为A相B相的体积；RV

3、为A、B两相的体积比。由此可见， Keffo 是RV的函数，溶质的有效分配系数可以调整两相的体积比而加以改变。 利用层析法分离混合氨基酸，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异。一般差异越大，越容易分开。 若是逆流分溶或逆流分配，当转移n次后，某一物质在（n+1）个管中分布的分数含量是（p+q)n=1展开式的相应项的值。这里p和q分别为某一物质在静相和动相中的分数含量，即p+q=1。例如物质Y的 Kd=q(动相)/(静相)p=1 即: p+q=1/2+1/2=1转移n次后,在第k号管中某一物质的含量可由下式计算: n！ pn-k+1 qk-1 Tn,k= （n-k+1）

4、！（k-1）！怎么办？例题：当某一物质在一个层析系统中的分配系数为3时，物质被转移4次后在第四管中的含量是多少？解：根据分配系数公式可知： p+q=1/4+3/4=1，即在静相中的分数含量为1/4，在动相中的分数含量3/4，则可由上述公式计算如下： 4！1/4 （3/4)3 T4,4=27/64 3！假若该物质的总量为96，则该管中的含量应为：（27/64） 96=40.56461813123641216486481616161632329271688816逆流分溶原理分配系数为1分配系数为3上相为动相（A），下相为静相（B） 2 4 6 8 10 12 14 16 管号302010Kd=1K

5、d=3管中物质的总量分溶曲线结论：分配系数大的物质沿一系列分溶管的移动速度快与分配系数小的物质n=600n=100n=10相对浓度溶剂系统体积 分溶曲线与转移次数（理论板数）的依赖关系(2)分配柱层析 层析柱中的填充剂或支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。支持剂表面附着一层不会流动的结合水作为固定相，沿固定相流过的与它互不相溶的溶剂（如苯酚、正丁醇等）是流动相。由填充剂构成的柱床可以设想为由无数的连续的板层组成，每一板层起着微观的“分溶管”作用。当用洗脱剂洗脱时，在柱上端的氨基酸混合物在两相之间按不同的分配系数进行连续不断的进行分配移动。分部收集层析柱下端的洗脱液，然后

6、分别用茚三酮显色定量，以氨基酸量对洗脱液体积作图得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。加洗脱剂氨基酸样品支持剂层析柱分部收集1.00.50.1光吸收值 20 40 60 80 100 120 流出液（毫升）（3）滤纸层析 滤纸层析也是分配层析的一种。这里的滤纸纤维素吸附水作为固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。 层析时，将样品点在滤纸的一个角上，称为原点。然后将其放入一个密闭的容器中，用一种溶剂系统进行展层，层析后烘干滤纸，再将其旋转90度采用第二种溶剂系统进行第二相展层。由于各种氨基酸在两个不同的溶剂系统中具有不同的迁移率

7、（ Rf ），因此它们就会彼此分开，当用茚三酮显色时，就会在滤纸上面出现各种氨基酸的斑点。当然，若氨基酸种类较少或一相就能分开，进行一相层析即可。 溶剂前沿氨基酸显色点滤纸原点XY滤纸层析中的Rf值， Rf =X/Y丁醇-醋酸酚-甲酚-水氨基酸的双向滤纸层析图谱（4）薄层层析（thin-layer chromatography)：该层析分辨率高，需量极少，层析速度快，可使用的支持剂种类多，如纤维素粉、硅胶、氧化铝等。其步骤大体如下：把支持物涂布在玻璃板上使其成为一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层，使样品中各个成分分开，最后进行鉴定和定量分析。

8、盖子层析缸溶剂薄层板（侧面）薄层层析装置（5）离子交换层析（ion-exchange column chromatography) 这是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。 CH2CH2CHCH2CH2CHSO3 CH CH2CH2CH苯环SO3有氢型和钠型H+或Na+H+或Na+树脂分阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交

9、换树脂含有的酸性基团如SO3H（强酸型）或COOH（弱酸型）可解离出H+离子，当溶液中含有其它阳离子时，例如酸性环境中的氨基酸阳离子，它们可以和H+发生交换而结合在树脂上。同样地阴离子交换树脂含有的碱性基团如N（CH3）3OH（强碱型）或NH3OH（弱碱型）可解离出OH-，它能和溶液中的阴离子如碱型环境中的氨基酸阴离子发生交换而结合在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度即氨基酸与树脂的亲和力，主要决定于：它们之间的静电引力；氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。在PH为3左右的氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电引力的大小次序是碱性氨基酸（R2+）大于中性氨基酸（R+），后者又大于酸型

10、氨基酸（R0）。因此，氨基酸的洗脱顺序大体上是酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸。但有时并不是这样，这是因为某些氨基酸和树脂之间还存在着疏水作用。 为了使氨基酸从树脂上洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，有效的方法是逐步提高洗脱剂的PH和盐浓度（离子强度），这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。（6）气相色谱 当层析系统的流动相为气体，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时，此层析技术称为气-液色谱（gas-liquid chromatography）或简称为气相色谱。它是利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相中的分配系数不同而达到分离组分的目的。 气相色谱需要气相色谱仪进行。 气相色谱

11、具有微量快速的优点。（7）高效液相色谱（high performance liquid chromatography，简称HPLC）：这是近十几年来发展起来的一种快速、灵敏、高效的分离技术。 HPLC的特点是：使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。因此多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析、离子交换层析、吸附层析以及凝胶过滤等。 蛋白质性质鉴定蛋白质性质鉴定 1 1 蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定 DSD-DSD-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶排阻层析凝胶排阻层析 电喷质谱电喷质谱 核磁共振核磁共振 2 2 蛋白质等电点的测定

12、蛋白质等电点的测定 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 PBE-SepharosePBE-Sepharose聚焦层析聚焦层析1 1概述概述1.11.1什么是蛋白质性质鉴定什么是蛋白质性质鉴定蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术, ,是确定是确定蛋白质产品的是与非的问题蛋白质产品的是与非的问题, ,尤其是在研究新的蛋白质组分尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最质作为突破口，然后根据它的基本

13、性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。1.21.2蛋白质鉴定的主要参数蛋白质鉴定的主要参数蛋白质分子是非常复杂的生物大分子蛋白质分子是非常复杂的生物大分子, ,能代表其特征参数很多能代表其特征参数很多. .但在但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种

14、。几种。(1)(1)蛋白质的质量鉴定蛋白质的质量鉴定( (分子量分子量) )(2)(2)蛋白质带电性鉴定（等电点）蛋白质带电性鉴定（等电点）(3)(3)蛋白质结构鉴定蛋白质结构鉴定( (一、二级结构、晶体结构、肽谱、一、二级结构、晶体结构、肽谱、N N和和C-C-末端末端) )(4)(4)蛋白质生物学功能鉴定蛋白质生物学功能鉴定( (生物活性、比活、酶促动力学生物活性、比活、酶促动力学) )( (5)5)免疫学鉴定（抗原免疫学鉴定（抗原- -抗体反应、酶联免疫反应）抗体反应、酶联免疫反应） 2 2蛋白质鉴定方法蛋白质鉴定方法 蛋白质可鉴定的参数很多，这里主要介绍蛋白质的分子量和等电蛋白质可鉴定

15、的参数很多，这里主要介绍蛋白质的分子量和等电点两个主要参数。点两个主要参数。2.12.1蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定 早期测定蛋白质分子量的方法是采用超速离心和光散射等方法。早期测定蛋白质分子量的方法是采用超速离心和光散射等方法。由于这些方法需要高级的精密仪器设备和大量的蛋白样品才能进行由于这些方法需要高级的精密仪器设备和大量的蛋白样品才能进行测定，所以目前采用的不多了。测定，所以目前采用的不多了。 自从葡聚糖凝胶层析介质自从葡聚糖凝胶层析介质(Sephadex G(Sephadex G系列产品系列产品) )及排阻层析技术及排阻层析技术问世以来，就被广泛应用于蛋白质的分子量测定。它是目前实

16、验室问世以来，就被广泛应用于蛋白质的分子量测定。它是目前实验室测定白质分子量常用技术之一。但是这种层析介质刚性较差，在层测定白质分子量常用技术之一。但是这种层析介质刚性较差，在层析过程流速较慢，分离时间长。析过程流速较慢，分离时间长。 近年来又研究出刚性的耐压的凝胶层析介质，被用于高效液相近年来又研究出刚性的耐压的凝胶层析介质，被用于高效液相色谱。大大的提高了工作效率和测定精度。色谱。大大的提高了工作效率和测定精度。 随着聚丙烯酰胺凝胶电泳的出现和发展，随着聚丙烯酰胺凝胶电泳的出现和发展，DSD-PAGEDSD-PAGE电泳成了常电泳成了常用的方法。从用的方法。从9090年代初期随着毛细管电泳

17、的出现，应用毛细管电泳年代初期随着毛细管电泳的出现，应用毛细管电泳无胶筛分技术来测定蛋白质分子量，是一种较好的选择。无胶筛分技术来测定蛋白质分子量，是一种较好的选择。 蛋白质氨基酸测序技术，质谱技术和核磁共振波谱技术的发展，蛋白质氨基酸测序技术，质谱技术和核磁共振波谱技术的发展，给蛋白质分子量测定技术增添了新的途径。尤其是采用电噴质谱测给蛋白质分子量测定技术增添了新的途径。尤其是采用电噴质谱测定蛋白质分子量，既快捷有准确。该技术在生物领域应用越来越广，定蛋白质分子量，既快捷有准确。该技术在生物领域应用越来越广，是一种快速精确的好方法。是一种快速精确的好方法。 蛋白质的分子量测定技术归纳起来大致

18、分三大类电泳技术，层蛋白质的分子量测定技术归纳起来大致分三大类电泳技术，层析技术，光谱分析技术。析技术，光谱分析技术。2.1.1 SDS-2.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠- -聚聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)polyacrylamide gel electrophoresis

19、, SDS-PAGE)。主要用于蛋白质亚基分子量的测定。它具有操作简单，主要用于蛋白质亚基分子量的测定。它具有操作简单，重复性好，对样品的纯度要求不高等特点，是目前使用重复性好，对样品的纯度要求不高等特点，是目前使用较为广泛的测定蛋白质亚基分子量的一种方法。较为广泛的测定蛋白质亚基分子量的一种方法。 (1)(1)原理：原理：a.a.蛋白质分子状态蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电

20、荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。定净电荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。b. b. 还原剂的解聚作用还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂 - -巯基乙醇巯基乙醇( ( - mercaptoethanol)- mercaptoethanol)或二硫苏糖醇或二硫苏糖醇(Dithiothretiol, (Dithiothretiol, DTT)DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打

21、开，形成长短不一的单链亚基。的单链亚基。c. SDSc. SDS的包裹作用的包裹作用 SDSSDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成的氨基酸侧链与的氨基酸侧链与SDSSDS结合，在结合，在SDSSDS的重量达到蛋白重量的的重量达到蛋白重量的3-43-4倍时蛋倍时蛋白质分子表面完全被白质分子表面完全被SDSSDS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子，包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质称之为蛋白质-SDS-SDS复合物复合物( protein-SDS micelles)( protein-SDS micelles)。

22、由于蛋白质。由于蛋白质- -SDSSDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS-SDS复合物在水溶液复合物在水溶液中的形状象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小中的形状象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。在电场下，蛋白质成正比。在电场下，蛋白质-SDS-SDS复合物就会向正极移动，移动的速复合物就会向正极移动，移动的速度与蛋白质本身带是什麽样的电荷和带多少电荷无关，只与椭圆棒度与蛋白质本身带是什麽样的电荷

23、和带多少电荷无关，只与椭圆棒状的长短有关，也就是与亚基的分子量的大小有关，利用这一性质状的长短有关，也就是与亚基的分子量的大小有关，利用这一性质可以测定蛋白质的分子量。可以测定蛋白质的分子量。d. d. 聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用 不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白质质-SDS-SDS复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，

24、电泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分开。开。 (2)(2)操作过程操作过程制胶制胶 加样加样 电泳电泳 固定固定 染色染色 脱色脱色 计算计算(3)(3)结果处理结果处理a. a. 电泳图谱电泳图谱1 2 3b. b. 标准曲线标准曲线绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)log(M)为纵坐标，为纵坐标，RfRf值值为横坐标，绘制标准曲线。为横坐

25、标，绘制标准曲线。44.24.44.64.855.200.20.40.60.81mRlgMr兔肌动蛋白牛血清白蛋白兔磷酸化酶牛碳酸酐酶胰蛋白酶抑制剂鸡蛋清溶菌酶c.c.未知蛋白分子量计算：未知蛋白分子量计算： 将未知蛋白的将未知蛋白的mRmR值查到值查到log(M)log(M)值，便可知其分子量。计算分子量值，便可知其分子量。计算分子量方法除了用标准曲线法外方法除了用标准曲线法外, ,还可以用比较法和机读法还可以用比较法和机读法. .比较法比较法: : 通常标准蛋白的相对位置与未知蛋白的位置进行比较，初步判通常标准蛋白的相对位置与未知蛋白的位置进行比较，初步判断。这是在发表论文时常用的表示方法

26、。断。这是在发表论文时常用的表示方法。机读法：机读法： 用凝胶扫描仪用凝胶扫描仪, ,将凝胶图谱扫描输入计算机中，通过影像文件系将凝胶图谱扫描输入计算机中，通过影像文件系统处理，便很快得知未知样品的分子量。但发表论文时统处理，便很快得知未知样品的分子量。但发表论文时, ,仍然要注仍然要注重原始图谱，经计算机处理的图谱有作假之嫌。重原始图谱，经计算机处理的图谱有作假之嫌。(4)(4)影响因素影响因素 影响影响SDS-SDS-复合物形成的主要因素。复合物形成的主要因素。SDS-SDS-电泳成败关之一，是在电泳成败关之一，是在制备样品的过程中，蛋白质与制备样品的过程中，蛋白质与SDSSDS结合的程度

27、直接影响电泳分离效结合的程度直接影响电泳分离效果。影响结合的因素主要有三个果。影响结合的因素主要有三个: :A A、溶液中溶液中SDSSDS单体的浓度单体的浓度 SDSSDS在水溶液中以单体和在水溶液中以单体和SDSSDS复合物混合存在的，能与蛋白质结复合物混合存在的，能与蛋白质结合的只能是单体。单体的浓度与合的只能是单体。单体的浓度与SDSSDS总浓度，温度和离子强度有关。总浓度，温度和离子强度有关。在一定温度和离子强度下，在一定温度和离子强度下，SDSSDS处于一饱和值，即单体浓度不再随处于一饱和值，即单体浓度不再随SDSSDS中浓度增加而增加。为了使中浓度增加而增加。为了使SDSSDS与

28、蛋白质结合充分，与蛋白质结合充分，SDSSDS和蛋白和蛋白质结合的重量比一般是质结合的重量比一般是4:14:1或或3:13:1。B B、样品缓冲液离子强度样品缓冲液离子强度 因为因为SDSSDS结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时SDSSDS单体浓度，单体浓度，而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，SDSSDS单体才具有较单体才具有较高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子强度，通常是高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子强度，通常是10-10-100mmol/l100mmol/l之间。之间。C C、二硫键是否完全

29、打开二硫键是否完全打开 只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开，蛋白质分子完全解聚，只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开，蛋白质分子完全解聚，SDSSDS充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。若蛋白质分子的全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。若蛋白质分子的二硫键只是部分被打开，这是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分二硫键只是部分被打开，这是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分子的混合物。子的混合物。2.1.22.1.2凝胶排阻层析凝胶排阻层析(1)(1)原理：原理： 凝胶排阻色谱凝胶排

30、阻色谱( Exclusion chromatography)( Exclusion chromatography)，也称为分子筛层，也称为分子筛层析、凝胶过滤层析。凝胶排阻色谱介质是以不同浓度的凝胶交联聚析、凝胶过滤层析。凝胶排阻色谱介质是以不同浓度的凝胶交联聚合而成的多孔径的，网状结构的球体。在色谱柱内不同大小凝胶的合而成的多孔径的，网状结构的球体。在色谱柱内不同大小凝胶的孔径可以通过不同大小的蛋白质分子。因此，凝胶排阻色谱介质对孔径可以通过不同大小的蛋白质分子。因此，凝胶排阻色谱介质对蛋白质分子具有排阻作用。在凝胶排阻色谱分离的分离过程中，大蛋白质分子具有排阻作用。在凝胶排阻色谱分离的分离

31、过程中，大分子先流出，小分子后流出。分子先流出，小分子后流出。(2)(2)蛋白质分子形状：蛋白质分子形状： 蛋白质分子一般有两种形状，一种是球形分子，另一种是线性蛋白质分子一般有两种形状，一种是球形分子，另一种是线性分子。在色谱过程中，大分子不能进入或不能完全进入凝胶内部孔分子。在色谱过程中，大分子不能进入或不能完全进入凝胶内部孔径而沿凝胶颗粒之间的空隙向前移动，迁移距离短，最先流出柱外径而沿凝胶颗粒之间的空隙向前移动，迁移距离短，最先流出柱外来。小分子可以进入凝胶内部孔径慢慢向前移动，迁移距离长，最来。小分子可以进入凝胶内部孔径慢慢向前移动，迁移距离长，最后流出柱外来。线性蛋白质分子与球形分

32、子比较，同样大小分子量后流出柱外来。线性蛋白质分子与球形分子比较，同样大小分子量的蛋白质，线性分子体积大流速快，球形分子体积小流速慢。因此，的蛋白质，线性分子体积大流速快，球形分子体积小流速慢。因此，在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都可进行分离，但是在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都可进行分离，但是球形分子比线性分子的分离度好。球形分子比线性分子的分离度好。(3) (3) 凝胶层析介质凝胶层析介质 凝胶层析介质主要有五类凝胶层析介质主要有五类Sephadex, BioSephadex, Bio gel, Sepharose, gel, Sepharose, utrol gel,

33、 perfusonutrol gel, perfuson等。等。A A、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex)(Sephadex) 葡聚糖凝胶是以葡聚糖为原料合成的珠状凝胶，其主要技术指标葡聚糖凝胶是以葡聚糖为原料合成的珠状凝胶，其主要技术指标介质规格介质规格溶胀体积溶胀体积(ml/mg)球形分子量范围球形分子量范围(Da)Sephardex G-102-3700Sephardex G-2541000-5000Sephardex G-5061500-30000Sephardex G-75103000-80000Sephardex G-10015-204000-100000Sephardex

34、G-20020-255000-250000 后面的阿拉伯数字越大，表示交联越小，凝胶孔径越大，分子量后面的阿拉伯数字越大，表示交联越小，凝胶孔径越大，分子量分离范围越大。凝胶的溶胀体积。分离范围越大。凝胶的溶胀体积。 凝胶性能：凝胶性能： 耐高温耐高温100 沸水煮沸水煮 pH范围范围pH2 11稳定稳定 在高盐浓度下体积易收缩在高盐浓度下体积易收缩B B、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(Boi(Boi gel)gel) Bio Bio gelgel是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联制成的球状凝胶色是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联制成的球状凝胶色谱介质。根据溶胀性质可分谱介质。根据溶胀性质可分Bi

35、oBio gel gel 、P P 2 2、P P 4 4 P P 300300等等1010种。种。其主要技术指标是：其主要技术指标是：介质规格介质规格溶胀体积溶胀体积(ml/mg)球形分子量范围球形分子量范围(Da)Bio-gel P-23.8200-2000Bio-gel P-45.8500-4000Bio-gel P-68.81000-5000Bio-gel P-1012.45000-17000Bio-gel P-3014.920000-50000Bio-gel P-6019.030000-70000Bio-gel P-10019.040000-100000Bio-gel P-15024

36、.050000-150000Bio-gel P-20034.080000-300000Bio-gel P-30040.0100000-400000 “P” “P”后面的拉伯数字越大，表示吸水性越大，凝胶的交联度越后面的拉伯数字越大，表示吸水性越大，凝胶的交联度越小，分子量分离范围越大与小，分子量分离范围越大与 SephadexSephadex相似。相似。 性能性能 ： 刚性好流速快刚性好流速快 在在pH 2-11pH 2-11的溶液中稳定的溶液中稳定 高温下酰胺基易被水解产生羧酸高温下酰胺基易被水解产生羧酸 对酸、碱性较强的物质及芳香族化类合物均用不同程度的吸附。对酸、碱性较强的物质及芳香族化

37、类合物均用不同程度的吸附。 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶SepharoseSepharose系列系列 琼脂糖凝胶是由琼脂糖经特殊工艺制成的珠状凝胶，琼脂糖中凝琼脂糖凝胶是由琼脂糖经特殊工艺制成的珠状凝胶，琼脂糖中凝胶的结构是氢键而不是共价键，因此胶的结构是氢键而不是共价键，因此, ,物理稳定性较差。通常把琼物理稳定性较差。通常把琼脂糖凝胶层析介质浸泡在水溶液中。其主要技术指标是：脂糖凝胶层析介质浸泡在水溶液中。其主要技术指标是：型号凝胶浓度(w/v)分子量分离范围sepharose2B2510515107sepharose4B4210515106sepharose6B651042106sepharos

38、e8B821047105sepharose12B1251035104 阿拉伯数字后面的阿拉伯数字后面的B B表示琼脂糖凝胶的百分浓度，琼脂糖浓度越大表示琼脂糖凝胶的百分浓度，琼脂糖浓度越大表交联度越大，表交联度越大， 分子量分离范围越小。与此相反琼脂糖浓度越小分子量分离范围越小。与此相反琼脂糖浓度越小表交联度越小，分子量分离范围越大。表交联度越小，分子量分离范围越大。 性能：性能： 耐温：耐温： 交联交联琼脂糖凝胶可耐受琼脂糖凝胶可耐受100100120120 耐酸碱：在耐酸碱：在pH3pH31212范围内稳定范围内稳定 耐盐：在耐盐：在6M6M尿素中稳定尿素中稳定(4)(4)方法方法介质溶胀

39、介质溶胀 装柱装柱 平衡平衡 上样上样 洗脱洗脱 计算分子量计算分子量 分离过程分离过程5) 5) 结果处理结果处理a a层析图谱层析图谱B B、 标准曲线标准曲线 分子量的测定方法，一般都采用标准曲线法。使用几种不同分子分子量的测定方法，一般都采用标准曲线法。使用几种不同分子量的混合标准蛋白，经排阻色谱进行分离会得到不同标留值的色谱量的混合标准蛋白，经排阻色谱进行分离会得到不同标留值的色谱峰，以分子量的对数值峰，以分子量的对数值(lgMr)(lgMr)为纵坐标，以收集体积为纵坐标，以收集体积(ml)(ml)为横坐标，为横坐标，绘制标准曲线图。然后将未知样的标流体积在准曲线先上查得分子绘制标准

40、曲线图。然后将未知样的标流体积在准曲线先上查得分子量。量。、C C、未知蛋白分子量计算未知蛋白分子量计算 将未知蛋白排阻层析的洗脱体积从标准曲线上查到相应的将未知蛋白排阻层析的洗脱体积从标准曲线上查到相应的log(M)log(M)值，便可求出其分子量。值，便可求出其分子量。(6)应注意的问题：应注意的问题：A、样品、样品: 前处理前处理: 样液要进行适当的前处理样液要进行适当的前处理, 如离心，沉淀，抽提等如离心，沉淀，抽提等浓度浓度: 样液浓度不宜太稀样液浓度不宜太稀组分组分: 样液组分不宜太多，目标组分与相邻组分之间的分子量至少样液组分不宜太多，目标组分与相邻组分之间的分子量至少要相差要相

41、差 2000以上。以上。B、上样：、上样：对组别分离对组别分离: 上样体积不超过柱床体积的上样体积不超过柱床体积的30左右左右对组分分离对组分分离: 上样体积不超过柱床体积的上样体积不超过柱床体积的1-2左右左右C C、流速流速: : 流速是指在单位面积液体所流过的量，排阻色谱要选择较理想的流速是指在单位面积液体所流过的量，排阻色谱要选择较理想的流速才能得到好的结果，选择的原则是：流速才能得到好的结果，选择的原则是：根据介质颗粒大小选择根据介质颗粒大小选择根据上样体积根据上样体积根据样品中的组分多少。根据样品中的组分多少。 2.32.3质谱法质谱法2.3.12.3.1原理：原理： 质谱仪是利用

42、电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压及电荷及电荷Z Z有关。有关。Z Z：电荷数：电荷数 ZeU=mvZeU=mv2 2/2 e/2 e：电荷：电荷(e = 1.60 x10(e = 1.60 x10-19-19C)C)U U：加速电压：加速电压m m：离子的质量：离子的质量v v：离子被加速后的运动速度：离子被加速后的运动速度 具有速度具有速度v v的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分的带电离子进入质谱仪的电

43、磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按离方式，最终实现各种离子按m/zm/z进行分离。进行分离。 根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器两大类，静态仪器采用稳定的电磁场，按空间位置来区别两大类，静态仪器采用稳定的电磁场，按空间位置来区别m/zm/z不同不同的离子。动态仪器采用变化的电磁场，按时间不同来区分的离子。动态仪器采用变化的电磁场，按时间不同来区分m/zm/z不同不同 的离子。的离子。 分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。基本原分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。基本原理是生物大分子在

44、很高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在理是生物大分子在很高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在高的電場下使生物分子从毛細管中流出來。高的電場下使生物分子从毛細管中流出來。2.3.22.3.2方法：方法： 样品溶液以很低的流速样品溶液以很低的流速(1-20l/(1-20l/分钟分钟) )从毛细管中流出来。在毛从毛细管中流出来。在毛细管的柱头上施加一个高电压细管的柱头上施加一个高电压(1-5kv)(1-5kv)，是柱头液体雾化成很细的，是柱头液体雾化成很细的带电液滴，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使液滴表面电荷带电液滴，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使液滴表面电荷密度增大。直到产生的

45、库仑斥与液滴表面张力的雷利极限值相等时，密度增大。直到产生的库仑斥与液滴表面张力的雷利极限值相等时，液滴就会发生爆裂，形成更小的子液滴，这些子液滴又被蒸发，又液滴就会发生爆裂，形成更小的子液滴，这些子液滴又被蒸发，又会形成爆裂。如此循环下去，直到液滴变得非常小，它的表面的电会形成爆裂。如此循环下去，直到液滴变得非常小，它的表面的电荷密度变得非常大，形成很强的电场，并从液滴中解离出带多电荷荷密度变得非常大，形成很强的电场，并从液滴中解离出带多电荷的分子离子。这些离子是靠吸附上或丢失若干质子而形成的，所以的分子离子。这些离子是靠吸附上或丢失若干质子而形成的，所以正离子或负离子谱上会观察到谱峰。生物

46、大分子在正离子或负离子谱上会观察到谱峰。生物大分子在ESIESI谱上往往是谱上往往是一组带不同的电荷的分子离子峰。一组带不同的电荷的分子离子峰。2.3.32.3.3结果结果2.42.4核磁共振波谱核磁共振波谱 核磁共振波谱核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy, (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).NMR).是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率的电磁波照射，是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率的电磁波照射，它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信它们就会吸收

47、能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于1 1H H和和1313C C核的共核的共振吸收波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。振吸收波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。到目前为止，采用到目前为止，采用1 1H 2D-NMRH 2D-NMR（二维（二维NMRNMR）能解决的最大蛋白质分子）能解决的最大蛋白质分子量在量在10000Da10000Da左右。如果采用杂核多维左右。如果采用杂核多维NMRNMR技术，能解决的最大蛋白技术，能解决的最大蛋白质分子量大在质分子量大在2

48、5000Da25000Da左右。左右。6 6几种测定蛋白质分子量方法的比较几种测定蛋白质分子量方法的比较方法方法机理机理分子量计算分子量计算关键技术关键技术特点特点电泳电泳分子表面电荷分子表面电荷电泳条带电泳条带(mR)SDS包裹包裹单链分子单链分子层析层析分子质量分子质量层析峰的位置层析峰的位置介质交联度介质交联度球形分子球形分子质谱质谱质荷比质荷比质谱峰直接标识质谱峰直接标识样品质子化样品质子化整体分子整体分子核磁核磁核磁共振波谱核磁共振波谱核磁谱线计算核磁谱线计算磁场能量磁场能量整体分子整体分子3 3蛋白质的等电点测定技术蛋白质的等电点测定技术3.13.1等电聚焦电泳等电聚焦电泳(Iso

49、electrofocusing(Isoelectrofocusing，简写，简写IEF)IEF)3.1.13.1.1原理原理 通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是6060年代初建立起来年代初建立起来的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最高的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最高的一种分离技术，其分辨率可以达到的一种分离技术，其分辨率可以达到0.010.01个个pHpH值，有的文献报道可值，有的文献报道可以达到以达到0.0010.001个个pHpH值。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电值。它是利用蛋白质分子或其它

50、两性分子的等电点的差异进行电泳分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性点的差异进行电泳分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性pHpH梯度的梯度的凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点的位置。动，聚焦在等电点的位置。3.1.23.1.2蛋白质与两性电解质蛋白质与两性电解质(1)(1)载体两性电解质：载体两性电解质： 在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能：在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具

51、有以下两种功能：A 中和功能：中和功能： 两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的pHpH梯度，提梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有供中和蛋白质电荷的离子，具有pHpH缓冲能。缓冲能。B 载电功能：载电功能： 两性电解质作为电的载体，具有运载两性电解质作为电的载体，具有运载“电流电流”的能力，有良好的能力，有良好的导电性能的导电性能(2)(2)蛋白质的等电点蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质。在不同的蛋白质属于一种两性电解质。在不同的pHpH环境中所带的正负电荷环境中所带的正负电荷不同。若在某特定的不同。若在某特定的pHpH环境中其净

52、电荷为零，此时的环境中其净电荷为零，此时的pHpH为该蛋白质为该蛋白质的等电点，在电场下不泳动。的等电点，在电场下不泳动。3.1.33.1.3载体两性电解质分类及载体两性电解质分类及pHpH范围范围 根据建立根据建立pHpH梯度的原理的不同，可以分为载体两性电解质梯度的原理的不同，可以分为载体两性电解质pHpH梯度梯度(Carrier Ampholytes pH Gradient)(Carrier Ampholytes pH Gradient)和固相和固相pHpH梯度梯度(Immobilized (Immobilized pH Gradient)pH Gradient)。前者是在电场中通过两性

53、缓冲离子建立。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pHpH梯度，后梯度，后者将缓冲基团作为凝胶介质的一部分，分辨率比前者高一个数量级。者将缓冲基团作为凝胶介质的一部分，分辨率比前者高一个数量级。 名名 称称产产 家家组组 成成分子范围分子范围pH范围范围AmpholinePharmacia (LKB)脂肪族多氨基脂肪族多氨基,多多羧基的异构体和羧基的异构体和同系物组成同系物组成1000-6000Da2.5-4.5 4-6.5 5-8.0 3.5-9.5PharmalytePharmacia七氨基多羧基七氨基多羧基1000-15000Da2.5-5 4-5.55-8.0 8-10 3-10Serv

54、alyteServa丙烯基乙胺与乙丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合烯基亚胺缩合800-1200Da2-4.04-6.0 6-8.0 2-11 载体两性电载体两性电解质解质国产国产脂肪族的多氨基脂肪族的多氨基,多羧基的异构体多羧基的异构体和同系物组成和同系物组成800-1200 Da3-9.5 3.5-5.54.0-6.0 6.0-9.0 7.0-103.1.43.1.4电极液电极液根据不同的根据不同的pHpH范围范围, ,选用不同的电极液选用不同的电极液, ,见下表见下表pH范围范围阳极电极液阳极电极液阴极电极液阴极电极液3.5-9.51mol/L 磷酸磷酸1 mol/L NaOH2.5-4.51

55、mol/L磷酸磷酸0.4M HEPES4.0-6.50.5 mol/L 醋酸醋酸0.5 mol/L NaOH5.0-8.00.5 mol/L 醋酸醋酸0.5mol/L NaOH2.5-4.01 mol/L 磷酸磷酸2%两性电解质两性电解质 pH6-83.5-5.21 mol/L 磷酸磷酸2%两性电解质两性电解质 pH5-74.5-7.01 mol/L 磷酸磷酸1 mol/L NaOH5.5-7.72%两性电解质两性电解质 pH4-61 mol/L NaOH6.0-8.52%两性电解质两性电解质 pH4-61 mol/L NaOH7.8-102%两性电解质两性电解质 pH4-61 mol/L N

56、aOH3.1.53.1.5方法方法制胶制胶 加样加样 电泳电泳 固定固定 染色染色 脱色脱色 计算计算3.1.6 pH3.1.6 pH值测定值测定(1)(1)标准曲线法：标准曲线法： 标准样品参照，绘制标准曲线标准样品参照，绘制标准曲线(2)(2)微电极法：微电极法： 微电极直接测定微电极直接测定3.23.2聚焦层析聚焦层析(chromatofocusing)(chromatofocusing)3.2.13.2.1原理原理(1)pH(1)pH梯度的形成梯度的形成 一般的离子交换色谱中，一般的离子交换色谱中，pHpH梯度的产生，通常利用梯度的产生，通常利用pHpH梯度混合器梯度混合器来制造连续的

57、来制造连续的pHpH梯度。而聚焦色谱则是利用离子交换剂本身的带电梯度。而聚焦色谱则是利用离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用形成梯度。当洗脱缓冲液通过聚焦离子交换介质时，基团的缓冲作用形成梯度。当洗脱缓冲液通过聚焦离子交换介质时，就会自动形成就会自动形成pHpH梯度。在高梯度。在高pHpH缓冲液的平衡，使色谱柱内的介质均缓冲液的平衡，使色谱柱内的介质均处于碱性条件，带有电负性的碱性基团，根据载体两性电解质的等处于碱性条件，带有电负性的碱性基团，根据载体两性电解质的等电点不同，所带的电荷有差异而形成电点不同，所带的电荷有差异而形成pHpH梯度。梯度。(2)(2)聚焦效应聚焦效应 当一种蛋白质在色谱

58、柱内随洗脱液前移至接近其当一种蛋白质在色谱柱内随洗脱液前移至接近其pIpI处时处时, ,此时的此时的移动速度明显减慢。如果同样的组分第二次加样，起初它带负电荷移动速度明显减慢。如果同样的组分第二次加样，起初它带负电荷, ,向正电荷向正电荷( (低低pH)pH)方向移动速度快，直至追上慢速移动的第一次加样方向移动速度快，直至追上慢速移动的第一次加样的组分，而聚焦到一起，然后两次加样的同一组分一起前移，直至的组分，而聚焦到一起，然后两次加样的同一组分一起前移，直至停留在停留在pIpI处。处。3.2. 2 3.2. 2 聚焦介质聚焦介质 聚焦介质是以交联的琼脂糖凝胶为载体合成的聚焦介质是以交联的琼脂

59、糖凝胶为载体合成的, ,具有凝胶介质的具有凝胶介质的基本特性，也有两性电解质的特性。目前用的较多主要基本特性，也有两性电解质的特性。目前用的较多主要(1)PBE118(1)PBE118偏碱性介质偏碱性介质(2)PBE94(2)PBE94偏中性介质偏中性介质3.2.33.2.3缓冲液缓冲液(1)(1)缓冲液分类缓冲液分类a.a.起始缓冲液起始缓冲液(start buffer)(start buffer)， 如：乙醇胺如：乙醇胺-HCl-HClb.b.样品缓冲液样品缓冲液(sample buffer), (sample buffer), 如：如：Tris-HAcTris-HAcc.c.洗脱缓冲液洗

60、脱缓冲液(eluting buffer), (eluting buffer), 如：如： polybuffer 96-HClpolybuffer 96-HCl(1)(1)始缓冲液及洗脱缓冲液的配制方法始缓冲液及洗脱缓冲液的配制方法介质介质pH范围范围起始缓冲液起始缓冲液PBE118(pH10.5-7)三乙胺三乙胺-HCl pH11.0PBE 94(pH9-6)乙醇胺乙醇胺-HCl pH9.4PBE 94(pH8-5)Tris-HCl pH8.3PBE 94(pH7-4)咪唑咪唑-HAc pH7.4PBE 94(pH6-4)组氨酸组氨酸-HCl pH6.2PBE 94(pH5-4)哌嗪哌嗪-HC