第二章 固定化载体的筛选

1、第二章 固定化载体的筛选 固定化酶的载体材料是影响固定化酶性能的重要因素之一。酶的固定化载体通常需要具备的性质有以下几点：带有能与酶发生反应的官能团；具有大的比表面积和多孔结构；不溶于水；机械刚性和稳定性都非常好；能防止微生物的降解作用。此外，还希望载体材料无毒、无污染、成本低廉、来源丰富。目前使用和研究中的固定化酶载体材料种类繁多，按其化学组成可以分为无机载体、天然高分子载体、合成高分子载体等。 2.1实验材料2.1.1试剂表2-1实验试剂试剂名称级别生产厂家D-葡萄糖AR国药集团化学试剂有限公司酵母膏AR南京宁试化学试剂有限公司蛋白胨BROXOID琼脂AR上海化学试剂厂磷酸二氢钾AR广东&

2、#183;汕头市西陇化学厂磷酸氢二钠AR广东·汕头市西陇化学厂考马斯亮蓝G-250 上海生工生物工程上海有限公司氯化钠AR上海四赫维化学公司异丙醇AR天津市福晨化学试剂厂离子交换树脂 安徽三星树脂科技有限公司戊二醛AR Siama 公司蔗糖AR 西陇化工股份有限公司乳糖AR 中国惠兴生化试剂有限公司乙醇AR 无锡市亚盛化工有限公司氢氧化钠AR 西陇化工有限公司浓盐酸AR 上海中试生化2.1.2仪器表2-2 实验仪器仪器名称规格与型号生产厂家酶标仪Power Wave XS美国BIO-TECH公司恒温培养箱PYX-DHS-40*50-BS上海跃进医疗器械厂超净工作台SW-CJ-1B苏州

3、净化设备厂电子天平BP110SSartorias精密PH计Cole ParmerCole Parmer Instrument Co.隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS上海市跃进医疗器械一厂手提式压力蒸汽灭菌锅YXQSG41280上海医用核子仪器厂电热恒温干燥箱HG202-1南京实验仪器厂752紫外光栅分光光度计752上海精密科学仪器有限公司快速混匀器SK-1常州国华电器有限公司高速离心机TGL-16G上海安亭科学仪器厂2.2 实验方法2.2.1 -呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液的制备 菌株：节杆菌Aspergillusoryzae arilatensis NJEM01 ，本实验室筛选获得。 工程菌

4、 E.coli BL21(DE3)/pET22b-fru6,本实验室构建。 培养基：LB氨苄固体培养基（g/l）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉18，灭菌冷却后加入无菌的氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100ug/ml。 LB氨苄液体培养基（g/l）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10,琼脂粉18，灭菌使用时加入无菌的氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100ug/ml。 从冻存管中转接重组菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-fru6于LB氨苄固体培养基上，37培养12h后，挑取一环菌于LB氨苄液体培养基中37，200r/mim,培养12h。以2%（v/v）的接种

5、量接入50ml新LB氨苄液体培养基中于37，200r/mim培养2h后，加入IPTG致终浓度为1mmol/l，30诱导培养8h。培养结束后将培养液以5000/mim，离心15min，收集上清即为-呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液，4保存。 -呋喃果糖苷酶Fru6酶活定义及反应体系反应体系：取离心后上清酶液50l加入950l蔗糖底物（1mol/l ，PH6.47PBS缓冲）中，置于35反应30min ，反应后煮沸10min。酶活力单位的定义为：35，PH6.47条件下，每分钟水解蔗糖底物（1mol/L）产生1mol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位（U即umol/(ml.min)）。2.2.3 固定化

6、载体材料的筛选2.2.3.1 大孔树脂的预处理（见图2-1）称取大孔树脂1g95%乙醇在30，200rpm摇床中浸泡2h加入5ml PH7的磷酸缓冲混合，在30，200r/mim摇床中放置12小时取出烘干，预处理完成图2-12.2.3.2 大孔树脂初步筛选大孔树脂树脂类型功能基团结构D301弱碱性阴离子交换树脂-N+(CH3)2 苯乙烯-二乙烯苯D201强碱性阴离子交换树脂N+(CH3)3 苯乙烯-二乙烯苯D101大孔吸附树脂非极性交联聚苯乙烯AB-8大孔吸附树脂弱极性交联聚苯乙烯BS-65大孔吸附树脂非极性交联聚苯乙烯DM301大孔吸附树脂中极性交联聚苯乙烯 表2-3 大孔树脂 称取D301

7、、D201、D101、AB-8、BS-65、DM301六种树脂（见表2-3）各1g，经过预处理后与酶、戊二醛混合,放在200rpm 、35 摇床固定4h，测量酶活，选择合适的树脂类型。2.2.3.3 弱碱性大孔树脂的筛选大孔树脂树脂类型功能基团结构D301弱碱性阴离子交换树脂-N+(CH3)2 苯乙烯-二乙烯苯D311弱碱性阴离子交换树脂NH2 丙烯酸甲脂、D318弱碱性阴离子交换树脂NH2 丙烯酸甲脂D330弱碱性阴离子交换树脂-NH2、=NH、=N、=N-环氧系D345弱碱性阴离子交换树脂-NH2、=NH、N酚醛系 表2-4 弱碱性离子交换树脂称取D301、D311、D318、D330和D

8、345五种弱碱性大孔树脂（见表2-4）各1g经过预处理后与酶、戊二醛混合,放在200rpm 、35 摇床里反应4h,固定完成，测量酶活选择合适的树脂基团类型。 将301、D311、D318三种树脂的固定化酶循环反应5次，观察重复利用性。选出其中最好的载体。2.3结果和讨论2.3.1 大孔树脂初步筛选图2-2：D301、D201、D101、AB-8、BS-65、DM301固定化效果从图2-2中可以看出，D301大孔弱碱性离子交换树脂固定化效果最好。D101等非极性树脂与酶进行吸附交联时，戊二醛不能与树脂交联，因此酶与载体的固定化方式仅仅是吸附，而我们的固定化体系是水相，酶的表面是亲水性氨基酸，吸

9、附的酶在水相中容易从载体中脱离，固定化效果不理想。D201是属于强碱性阴离子交换树脂，而酶在强酸强碱中容易失活，所以固定化效果不及D301弱碱性树脂。所以弱碱性离子交换树脂可能适合于酶的固定化，我们选择其他4种弱碱性阴离子交换树脂，从中选择出最好的树脂。2.3.2 弱碱性大孔树脂的筛选图2-3 ：D301、D311、D318、D330和D345固定化效果从图2-3可以看出，D301、D311和D318三种大孔树脂固定化效果要比D330和D345好。D301、D311和D318三种载体的表面都是伯胺基，而D330和D345两种载体上表面基团有伯胺、仲胺和叔胺，可能仲胺与叔胺不能与戊二醛发生交联，这两种载体的伯胺基少于其他三种，所以固定化效率不及带有伯胺基的树脂。因此我们实验选择带有伯胺基的大孔树脂作为固定化材料。接下来对第三种带有氨基的树脂进行重复批次实验，选择重复利用性好的树脂。图2-4 D301 大孔树脂重复利用性实验 图2-5 D311大孔树脂重复利用性实验图2-6 D318 大孔树脂重复利用性实验图2-7 三种大孔树脂重复利用性（5批） 从图2-4到图2-7四幅图中可以看出，在前五批批次上，