第六章目的基因的分离

1、第六章目的基因的分离 基因工程的上游工程是目的基因的基因工程的上游工程是目的基因的制取和无性繁殖。制取和无性繁殖。 具体地说是从生物体的组织、具体地说是从生物体的组织、 器官器官或细胞制取目的基因，或人工合成目的或细胞制取目的基因，或人工合成目的基因，使目的基因与载体连接，导入受基因，使目的基因与载体连接，导入受体细胞，筛选和进行无性繁殖。这个过体细胞，筛选和进行无性繁殖。这个过程称为基因克隆（程称为基因克隆（gene cloninggene cloning）。）。克隆的概念:个体水平上个体水平上: 表示由具有相同基因型的同一物种的两个体或数个个体组成的群体,如双胞胎.细胞水平上细胞水平上:由

2、同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体.分子水平上分子水平上:凡带有一段DNA插入序列的,独特的寄主/载体单元亦叫克隆.比如重组质粒载体 PCR或人工合成法 从基因组文库或cDNA文库中分离基因 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法 基因文库：指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合 按照外源 DNA 片段的来源，可将基因文库分为：基因组 DNA 文库（genomic DNA library）和 cDNA 文库（complementary DNA librar

3、y）。 从基因文库中克隆目的基因从基因文库中克隆目的基因(一) 概念： 将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成 cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后转化给大肠杆菌寄主细胞，这个细胞群体内包含了所有基因编码序列的cDNA分子，被称为cDNA文库。 只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定的状态是由特定基因的表达所决定，因此各自的mRNA的种类不同，由此产生出独特的cDNA文库。任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。 以mRNA为材料,特别适用于某些RNA病毒 筛选比较简单易行. 假阳

4、性概率低 cDNA克隆可进行原核表达 文库的代表性:文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性. N=Ln(1-P)/Ln(1-n/T)P:文库中筛选出某一确定克隆的置信度,一般情况下选择0.99.N:文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数;n:细胞中最低丰度的mRNA的拷贝数;T: 细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数 重组cDNA片段的序列完整性(二)、构建cDNA文库的方法（1）分离细胞总RNA，从中分离出mRNA。（2）以mRNA为模板，逆转录合成第一条cDNA链。（3）将mRNA-DNA杂交分子转变为双链DNA分子。（4）将合成的双

5、链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞内增殖。 通常用gt10/gt11及与其相当的载体来组建非表达的cDNA文库，而一般不用转化效率较低的质粒作载体。 c cDNA第一链的合成第一链的合成 5pppG AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5dNTPs逆转录酶5pppG AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一链c cDNA第二链的合成第二链的合成 自身引导法：获得的双链自身引导法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失5pppG AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTT

6、TTTTTTTTp 5NaOH煮沸煮沸TTTTTTTTTTTTTTp 5OH 3KlenowdNTPsTTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3S1AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTc cDNA第二链的合成第二链的合成 置换合成法：获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5RNaesHDNApol dNTPs AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55AAAAAAAAAAAAAAp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3S1T4-DNA ligaseAAAA

7、AAAAAAAAAA55TTTTTTTTTTTTTT33cDNA第二链的合成引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列ppp5G AAAAAOH 3TTTTTp 5TdTdCTPppp5G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 5NaOH退火退火5 pGGGGGGG5 pGGGGGGGAAAAAOH 3KlenowdNTPsTTTTTp 5 双链平头的双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法通常可以使用下列三种方法克隆入载体中克隆入载体中: :平头末端直接与载体连接平头末端直接

8、与载体连接,但插入的片段无法回收但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，重组分子可通过加热局部变性平头两端分别接同聚物尾，重组分子可通过加热局部变性和和S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 核酸杂交 免疫学杂交检测:通过重组克隆所表达的基因产物筛选目的克隆 如果双链cDNA重组到表达载体上，则cDNA就能随着表达载体而表达出融合蛋白质，这样的文库称为cDNA表达文库 PCR 并非所有的并非所有的mRNA分子都具有分子都具有polyA结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNA半衰期很短半衰期

9、很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 基因库（基因库（gene pool）:特定生物体全基因组的集合特定生物体全基因组的集合（天然存在）（天然存在） 基因组文库（基因组文库（gene library or gene bank） 将某种生物细胞的整个基因组将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增的宿主细胞中保存和扩增.理论上讲，这些重

10、组载体上带有理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因组文库。了该生物体的全部基因，称为基因组文库。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，片断数目越少，所需的重组子越少所需的重组子越少目前常用的载体目前常用的载体 载体系列：载体系列： 容量为容量为 23 kb cosmid载体：载体： 容量为容量为 45kb YAC： 容量为容量为 450-1 Mb BAC: 容量为容量为 300 kb（1 1）文库的完整性）文库的完整性: : 在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数克

11、隆数N之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中：其中： P = P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率;f = ;f = 克隆片段的平均大克隆片段的平均大小小 / / 生物基因组的大小生物基因组的大小 例如，人的单倍体例如，人的单倍体DNA总长为总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为，则构建一个完备性为0.9的的基因文库至少需要基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到万个克隆；而当完

12、备性提高到0.9999时，基因文库至少需要时，基因文库至少需要180万个克隆万个克隆（2 2） 基因组信息的可重建性基因组信息的可重建性 基因组基因组DNA的分离制备的分离制备 DNA大片段的制备大片段的制备 : 超声波处理和超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法限制性内切酶部分酶切两种方法 载体载体DNA的制备的制备：常用噬菌体DNA或粘粒作为载体;双臂的制备，除去非必要区段。 载体与基因组载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接 体外包装及基因组文库的扩增体外包装及基因组文库的扩增 重组重组DNA的筛选和鉴定的筛选和鉴定 鸟枪法：用生物化学方法，如用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，

13、得到很多在长度上同一般基因大小相当的DNA片段，然后将这些片段混合物随机重组入适当的载体，转化后在受体菌中进行扩增，再用适当的方法筛选出目的基因。 噬菌体及其衍生载体构建的DNA文库的保存:分装,2%-3%氯仿4度保存数月.填加7%的二甲基亚砜,80度保存数年. 大片段的基因文库: 含抗冻液和抗生素的96孔或384孔无菌培养板保存 7.5%的甘油可作为抗冻液. 使用使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物学合成聚合反应必需的双引物 1 引物设

14、计:决定扩增效果的关键 可在5端添加限制性内切酶识别序列及保护碱基. 引物效果检验和PCR参数确定 退火温度影响最大2 常规PCR反应的产物一般在3kb以下,主要是因为随着扩增片段延长,扩增效率降低. 由由Taq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCR产物中，其产物中，其3末端末端总是总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是总是A，因为因为Taq DNA聚合酶对聚合酶对dATP具有优先聚合活具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末末端加同聚尾的方法与载体端加同聚尾

15、的方法与载体拼接，也可以使用专门的拼接，也可以使用专门的T载载体克隆体克隆 反向PCR 锚定PCR 逆转录PCR cDNA末端的快速扩增(RACE) 也是获得已知DNA序列侧翼未知序列的一种PCR方法 设计3个嵌套的特异性引物和一个短的随机简并引物,以DNA为模板,根据引物长度及特异性差异设计不对称的温度循环,通过分级反应扩增特异产物 一般分三轮反应: 第一次反应包括第一次反应包括5次高特异性、次高特异性、1次低特异、次低特异、10次较低特异性反应和次较低特异性反应和12个热不对称的超个热不对称的超级循环。级循环。5次高特异性反应，使次高特异性反应，使sp1与已知与已知的序列退火并延伸，增加了

16、目标序列的浓的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；度；1次低特异性的反应使简并引物结合到次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；较多的目标序列上；10次较低特异性反应次较低特异性反应使使2种引物均与模板退火，随后进行种引物均与模板退火，随后进行12次超次超级循环。经上述反应得到了不同浓度的级循环。经上述反应得到了不同浓度的3种种类型产物：类型产物： 由特异性引物和简并引物扩增出的产物；由特异性引物和简并引物扩增出的产物；由同一特异性引物扩增出的产物；由同一特异性引物扩增出的产物；由同一简并引物扩增出的产物。由同一简并引物扩增出的产物。 第二次反应则将第一级反应的产物稀释第二次反应则

17、将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过倍作为模板，通过10次热不对称的超次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的的PCR反应或热不对称超级循环，通过上反应或热不对称超级循环，通过上述述3次次PCR反应可获得与已知序列邻近的目反应可获得与已知序列邻近的目标序列。标序列。 化学合成目的基因的前提条件是基因编化学合成目的基因的前提条件是基因编码的氨基酸序列或基因的码的氨基酸序列或基因的DNA序列已知序列

18、已知化学合成化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种法、亚磷酸三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；

19、后者反应中间物的分离程序简便，序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的磷酸二酯法磷酸二酯法 :原理:将两个分别在将两个分别在55或或33末端带有适当保末端带有适当保护基的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个护基的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸。为了保带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸。为了保证合成反应定向进行，以获得特定序列和证合成反应定向进行，以获得特定序列和形成形成3535磷酸二酯键，必须将不参加反磷酸二酯键，必须将不参加反应的基团用适当的保护基团选择性的保护应的基团用适当的保护基团选择性的保护起来。起来。 原理与磷酸二

20、酯法一样。只是参加反应的原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸单核苷酸,是一种核苷是一种核苷3-单磷酸的衍生物单磷酸的衍生物,都都是在是在3端磷酸和端磷酸和5-OH上都先连接了一个保上都先连接了一个保护基团，合成的二核苷酸连接处有三个酯护基团，合成的二核苷酸连接处有三个酯键键 目前DNA自动合成仪采取的方法寡核苷酸连接法寡核苷酸连接法 化学合成的化学合成的DNA片断一般在片断一般在200bp以内以内1 互补连接法互补连接法2 互补延伸连接法互补延伸连接法 预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用另一个片断延长的引物，

21、用DNA聚合酶延伸成完整的聚合酶延伸成完整的双链双链用用T4多核苷酸激酶使各个片段的多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。端带上磷酸。T4多核苷酸激酶，使多核苷酸激酶，使5-OH磷酸化磷酸化- T4 DNA连接酶连接酶-完整的完整的DNA双链双链 直接合成基因直接合成基因 合成引物（合成引物（20mer左右）左右） 合成探针序列，合成探针序列， 定点突变合成（定点突变合成（合成带有定点突变的基因片断），）， 合成人工接头或衔接物（合成人工接头或衔接物（含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列）。 差异显示PCR 差别杂交 扣除杂交 RNA任意引物PCRmRNA差别

22、显示技术差别显示技术mRNA差示反转录PCR技术（mRNA differential display reverse transcription PCR ,DDRT-PCR）一种用于分离和克隆真核生物正常与异常细胞之间差异表达基因的PCR方法 。根据表达差异将高等真核生物基因分为两大类:看家基因(house-keeping gene):以组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动.发育调控基因(developmental regulated gene):以时空特异性表达模式完成个体的正常的生长,发育与分化.基因的差别表达:生物个体在发育的不同阶段,或在不同组织或细胞中发生的不同基因按时间空间进行有序

23、的表达方式,叫- 真核基因真核基因mRNA分子的分子的3末端绝大多数都带有一段末端绝大多数都带有一段Poly(A)尾巴。在这段尾巴。在这段Poly(A)序列起点碱基之前序列起点碱基之前5上游的两个碱基有上游的两个碱基有12种组合（种组合（CG，GG，AG，TG，CT，GT，AT，TT，CC，GC，AC，TC）根据这）根据这种序列结构特征，按照碱基配对原则，人工合成种序列结构特征，按照碱基配对原则，人工合成Oligod(T)引物时，在其引物时，在其3端加上两个碱基端加上两个碱基（5T12MN，M为为A，G ，C中任一种，中任一种，N为为A，G，C，T中任一种）因此引物可将中任一种）因此引物可将1/12的的mRNA反转录反转录成成cDNA，并用此引物锚定，并用此引物锚定cDNA第二条链的第二条链的3端，端，用另一个随机寡核苷酸引物组成的用另一个随机寡核苷酸引物组成的5端引物与端引物与cDNA第一条链互补进行第一条链互补进行PCR扩增，由于扩增，由于5端随机引物结端随机引物结合在合在cDNA的互补靶点上，来自不同的互补靶点上，来自不同mRNA的扩增的扩增片段大小有差异，对片段大小有差异，对PCR产物进行电泳，染色或扩产物进行电泳，染色或扩增时用增时用32S标记的标记的dATP代替代替dATP在测序胶