第八章20104miRNA

1、miRNA与siRNA非编码小分子RNAmiRNAsiRNA非编码小分子RNA从“生物垃圾”到“年度分子” 真核生物基因组中99%为非编码序列，外显子和调控序列外称为“垃圾” 非编码序列转录出的RNA为“垃圾RNA分子” 非编码核糖核酸：除成熟mRNA分子外所有独立存在的RNA分子。 进化越高，“垃圾”越多？ 1993年，线虫，lin-4 2000年，线虫，let-7 很快分离出一类21-22 小分子RNA 1998, RNA干扰现象 2001，人工合成，siRNA，抑制同源序列基因的表达 至此，“垃圾”变“宝物” 非编码RNA的研究成果先后7次在近10年scince评选：年度十大科技突破 2

2、000年，RNA的研究进展被美国科学杂志评为重大科技突破； 2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”； 2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。 同时， Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成功之一。 2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位。 RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与HGP（人类基因组计划，生物通网站注）相提并论的最重大成果之一 除了除了mRNA、tRNA、rRNA三种三种RNA外外，细胞的不同部位存

3、在的许多其他种类的小，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子分子RNA，统称为非，统称为非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 u snmRNAs:u snmRNAs的种类的种类:核内小核内小RNA (small nuclear RNA, snRNA)核仁小核仁小RNARNARNA (small nucleolar RNA, snoRNA)胞质小胞质小RNA RNA (small cytoplasmic RNA, scRNA)催化性小催化性小RNA RNA (small catalytic RNA)小片段干涉小片段干涉 RNARNA (s

4、mall interfering RNA, siRNA)起始起始RNARNA (initiator RNA，iRNA) 微小微小RNA（micro RNA, miRNA） u snmRNAs的功能：的功能： U系列系列snRNA与蛋白质结合构成与蛋白质结合构成snRNP，参与参与hnRNA和和rRNA的加工和转运。的加工和转运。如如U1、U2、U3、U4、U5、U6等。等。多种多样多种多样 siRNA和和miRNA参与某些基因表达调控。参与某些基因表达调控。 iRNA作为作为DNA合成的引物。合成的引物。MicroRNAmicroRNA是谁？ MicroRNA也可以写做miRNA ，是一种21

5、25nt长的单链小分子RNA。 它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF）。成熟的miRNA，5端有一个磷酸基团，3端为羟基。 编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体（pre-miRNA）并经过Dicer酶加工后生成。 成熟的miRNA 5端的磷酸基团和3端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。 miRNA 5端第一个碱基对U（尿苷）有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。

6、这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。 miRNA研究的开端 miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。 1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个定时调控胚胎后期发育的基因lin-4 2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7 2001年10月science报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，

7、称为microRNA。 随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs，并且发现它与多种重要的生命过程有关。 MiRNA的作用方式 miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种： 第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性（不改变mRNA丰度），这种miRNA是目前发现最多的种类； 第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA； 第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式：当与靶标基因完全互补结合时，直接

8、靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3端非翻译区不完全配对结合后，抑制调节基因的翻译。Differences in miRNA Mode of ActionGenomics of microRNAMiRNA的特异性 研究表明MiRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是miRNA表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象

9、；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点基因表达时序性。 MiRNA表达的时序性和组织特异性暗示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。MiRNA的产生“话说在“广袤”的细胞质中游荡着一个名叫Dicer的浪子。与此同时，在细胞的腹地细胞核中，一个身形颀长的RNA降生了即pri-miRNA。Dicer在细胞质中遇到了一个双链的RNA并被她所吸引，于是尾随她并最终在她身上咬了一口，结果siRNA降生了。D

10、icer又继续游荡，这时他看到了一个非常漂亮的发夹状的RNA（她其实就是在细胞核中降生的那条RNA的化身pre-miRNA），于是非常仰慕并最终历经艰辛将她咬了一口。这样我就“哇”的一声来到了这个世界上”miRNA说。“我和siRNA有许多共同点，但我们的差别也很多，所以可别把我们混在一起哦，”它补充说。 MiRNA的功能研究 最近，miRNA常常在那些顶级杂志上露面，人类对它在生长发育中的调节功能以及与疾病关系的了解也一点一点地在增加。 研究发现miRNA的主要功能是调节生物体内在的与体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，而且研究人员推测这种小分子调节着人类三分之一的基因！ 目前认为m

11、iRNA在人体中有200多种类型。发表在6月2日的Nature杂志上的一项研究表明miRNA与感染的病毒的复制有关之前认为这种分子只与内生的物质的调节有关，而于外源病毒的调节无关。因此，这一发现对miRNA的功能有了新的认识 2005年6月9日的自然杂志上的文章显示microRNA的活动模式能够被用于诊断癌症。 研究人员Todd R. Golub和Robert Horvitz等人证明miRNA表达特征能用于划分人类癌症以及区别正常细胞和癌细胞。研究表明miRNA表达特征甚至能够鉴别出那些从外形上无法确定的癌细胞。 发表在同期自然杂志上的第二篇文章表明一种特殊的miRNA束能够导致小鼠的淋巴瘤。

12、 由霍普金斯大学医学院的Joshua Mendell和同事发表在自然的第三篇文章显示一些miRNA与一种已知能导致人类癌症的基因相互协作。这让人怀疑miRNA可能充当一种新型的癌基因。通过确定出大多数常见癌症中表达的特殊miRNA以及分析它们对癌症发生和癌症基因的影响，这三项同期公布在自然杂志上的研究改变了癌症遗传学的前景。 新的研究表明miRNA在从癌症、心脏病到艾滋病的各种疾病中起到一定的作用，而且有间接的证据表明如果将两个miRNA从人类基因组中删除就会发生白血病。 对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细

13、胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)。miRNA controls some plant phenotypemiRNA controls the miRNA controls the differentiation of the differentiation of the hematopoietic stem cellhematopoietic stem cellExpression studies on Expression studies on mammalian microRNAsmammalian microRNAsObesity 肥胖Host-virus interacti

14、on: a new role for Host-virus interaction: a new role for microRNAsmicroRNAsmiRNA and CancermiRNA and CancerComparison of small RNAComparison of small RNAcharacterization methodscharacterization methodsMicroRNA Quantitation by RT-MicroRNA Quantitation by RT-PCRPCRMicroRNA Quantitation by RT-PCRMicro

15、RNA Quantitation by RT-PCRSBC-miRNA microarryhybridization resultScanner=GenePix 4000BWavelengths=635,532PMTGain=650,600扫描像素值： 5m，PMT(%)数值：100肝癌CY5癌旁CY3MIR-122a为肝标志小RNAMIR-19b为癌标志小RNAScanner=GenePix 4000BWavelengths=635,532PMTGain=650,600扫描像素值： 5mPMT(%)数值：100肝癌CY5癌旁CY3MIR-122a为肝标志小RNAMIR-155,20a ,le

16、t7 family为癌标志小RNAsiRNA 小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸

17、根，2个核苷和3个悬臂。 在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNA）来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具。 图1 dsRNA可以沉默目标基因。在植物中，通过注入人工合成的RNA病毒或者是插入反向重复序列可以诱导目标基因沉默。在线虫中，沉默也可以用注射dsRNA的方式来诱导。这两种生物体中，沉默是系统的并且传遍全身。a) 沉默信号从脉杆传到叶片组织。绿色是绿色荧光蛋白；红色是叶绿素荧光，可以在绿色荧光蛋白被沉默后看出。b,c）通过实验，使得线虫的核中表达绿色荧光蛋白。实验者在左边加上对照dsRNA，右边加上绿色荧光蛋白的d

18、sRNA。一些神经元核仍然可以检测到荧光，对应于少量的蛋白质表达。c）Hela细胞加上ORC6 siRNA之后，针对微管蛋白（绿色）和DNA（红色）进行染色。ORC6的去除导致多核细胞的积累。稳定的沉默也可以通过表达发夹结构或者折回的双链RNA的表达来实现。d）当和野生型的果蝇相比（右边），成体果蝇中表达控制白色基因的发夹同源物（左边）导致眼睛丧失色素。 1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现2125nt 的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要，而在转基因正确表达的植株中则未出现。 随后，Hammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RN

19、Ai 中的作用，这些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。 RNAi能够调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。 RNAi的发现不仅提升了人们对RNA分子的认识，还大大推进基因功能的研究，更为各种类型的传染病和癌症提供了一种新的手段。 近年来，有关RNAi研究成果令人眼花缭乱：人们利用RNAi途径来人为调节特定基因的表达以达到治疗遗传疾病甚至癌症的目的，而且已经有不少的成功信息公布。 siRNA是RNAi途径的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。相同点/联系点siRNAmiRNA长度及特征都约在22nt左右，5端是磷酸基，3端是羟

20、基合成的底物miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的Dicer酶依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白参与RISC组分二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了on target和off target的问题作用方式都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用进化关系可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA不同点/分歧点siRNAmiRNA机制性质往往是外源引起的

21、，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况是生物体自身的一套正常的调控机制直接来源长链dsRNA发夹状pre-miRNA分子结构siRNA是双链RNA，3端有2个非配对碱基，通常为UUmiRNA是单链RNA对靶RNA特异性较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变相对较低，一个突变不影响miRNA的效应作用方式RNAi途径miRNA途径生物合成，成熟过程由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)；这些pre-miRNAs在转运

22、到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs；发生在细胞核和细胞质中不同点/分歧点siRNAmiRNAArgonaute (AGO) 蛋白质各有不同的AGO蛋白质各有不同的AGO蛋白质互补性（complementarity）一般要求完全互补不完全互补，存在错配现象RISCs的分子量不同(Martinez and Tuschl, 2004; Martinez et al., 2002; Nykanen et al., 2001; Pham et al., 2004)siRISCsmiRISCs/miRNP各自的生物学功能不同抵抗病毒的防御机制；沉默那些过分表达的mRNA；保护基因组免受转座子的破坏对有机体的生长发育有重要作用(Rhoades et al., 2002)重要特性高度特异性高度的保守性、时序性和组织