丙型肝炎病毒实验室诊断的现状和存在问题

1、.丙型肝炎病毒实验室诊断的现状和存在问题【摘要】 实验室诊断方法对丙型肝炎病毒（HCV）感染的确认和治疗的监测起着关键作用。自从1989年HCV被鉴定至今近20年间，随着分子生物学检测技术的发展，HCV的实验室诊断也取得了长足进步，但同时也有很多问题需要研究和解决。HCV抗体检测操作简便，耗时少，但对处于窗口期的标本容易漏检，且不能判别是活动性感染还是感染已被清除。HCV RNA检测有较高的灵敏度和特异性，定量检测还可以用于抗病毒治疗监测；国际上，RNA检测的发展趋势为全自动化。目前RNA检测亟待解决的两个问题是标准化和高成本问题。近五年HCV抗原检测和抗原抗体联合检测试剂盒也已问世，但其灵敏

2、度尚不及RNA。HCV基因分型主要基于核酸杂交或直接测序原理，均有相应的商品化试剂盒，但其高成本限制了在临床实验室的广泛应用。【关键词】 丙型肝炎病毒；实验室诊断Progress and Challenges in the Laboratory Diagnosis of Hepatitis C Virus WEI Lai, Yang Ruifeng. Beijing University Peoples Hospital, Beijing University Hepatology Institute【Abstract】Hepatitis C virus (HCV) is a common b

3、lood-borne pathogen that relies heavily on laboratory assays for the confirmation of infection. Anti-HCV testing is the earliest and classical method which is easy to perform but has a long window period (78 weeks with the third-generation method) compared to the nucleic acid test (NAT). NAT provide

4、s direct evidence for the presence of HCV and quantitative HCV RNA testing has been applied to monitor the antiviral response to treatment. In some developed countries NAT is also used for blood screening. Cost-effectiveness and standardization are the major challenges for NAT. In recent years HCV c

5、ore antigen assay and the combination antigen-antibody assay have been introduced in some clinical laboratories and proved to be promising in the early diagnosis of HCV, whereas they still remain less sensitive than NAT and require methodological improvement. Finally, HCV genotyping assays based on

6、sequencing or reverse hybridization can provide important prognostic information related to therapeutic response, however, it is rarely used in China due to the high cost.【Key words】 Hepatitis C virus; Diagnosis, Laboratory丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）以血液和性传播为主要传播手段，发病隐匿，症状不典型，加之公众对其认知水平较低，因此病毒的传播不

7、易控制，患者也容易因不能及时诊断而错过治疗的最佳时机。我国丙型肝炎感染高发时间在上世纪80年代末90年代初，90年代流行病学调查显示HCV抗体流行率约为3.2%，高于世界平均水平。经过20年的发展，目前更多感染者出现了临床表现，在国家传染病报告中丙型肝炎的报告率逐渐增多，感染所带来的严重后果正日益显现。控制丙型肝炎的传播、提高丙型肝炎的治疗效果需要依赖于及时、准确的实验室诊断。1989年Choo1等首次应用分子生物学方法筛选得到一段来源于HCV的cDNA，并检测到了HCV抗体，次年第一代HCV抗体EIA试剂获得FDA批准并运用到血液制品筛查中，极大降低了HCV血源性传播的几率，在HCV的检测上

8、具有里程碑式的意义；之后得益于分子诊断技术的进步，核酸检测（nucleic acid test, NAT），包括HCV RNA定性、定量检测应用于临床，大大缩短了HCV感染诊断的“窗口期”，也使抗病毒治疗的监测成为可能，特别是基于荧光共振能量转移原理的实时荧光PCR仪的应用，降低了扩增产物污染的可能性，简化了实验操作，使得PCR检测发生了革命性变化，分子诊断从此得到推广普及；近几年来，HCV抗原检测及抗原/抗体联合检测试剂也相继问世。检测技术的进步和新技术的出现提高了HCV的实验室诊断水平，但各个方法也存在不少问题，需要我们今后研究和解决。一、 HCV抗体检测： 经典，但有局限性HCV抗体检测

9、诞生于上世纪90年代初，是最早用于HCV实验室诊断的方法，具有操作简便、耗时短等优点，被广泛运用于血液制品的筛查选和临床诊断。目前大部分临床实验室使用第三代HCV抗体检测试剂，采用间接酶联免疫或微粒化学发光法，包被抗原除重组核心抗原外，还包括非结构蛋白NS3，NS4和NS5。在HCV低流行率人群如无偿献血者中，HCV抗体假阳性问题一直比较突出。根据美国CDC的研究结果，获FDA批准的Abbott HCV 2.0 及Ortho HCV 3.0 在抗体阳性率<10%的各类人群中，假阳性率平均为35%。引起假阳性的原因很多，如重组蛋白纯度不足、血清成分如类风湿因子的干扰等等。2003年美国CD

10、C发布HCV抗体报告和实验室检测导则, 抗HCV抗体仅仅在重复检测S/CO3.8时才可能为真阳性，S/CO<3.8时应该进行重组免疫印迹（RIBA）的补充检测2；而S/CO值在0.5到1.0之间的高值阴性样品应注意是否为假阴性3。我国HCV抗体检测试剂自1993年面世以来，经广大科技工作者和生产单位努力，经过国家“八五”到“十五”攻关，质量在不断进步，与当前国外主流的三代试剂相比，我国HCV抗体检测试剂在灵敏度和特异性上与国外基本没有差异，并且国产试剂在提高了对NS3抗原检测力度的同时，保持了对核心抗原检测的敏感性4。但相比国外产品，国产试剂有两个特点：（1）阴阳性样品的OD值差别较小，

11、不能将阴阳性分得很开，对处于临界值附近的样品易检测为假阳性或假阴性，这可能与抗原纯度不足或第二抗体浓度较高等因素有关；（2）不同国产试剂对真阳性的判定阈值S/CO各不相同，国外试剂一般为S/CO3.8判定为真阳性，而7种国产试剂S/CO从6.0到14.0不等5，这就要求我们不能套用美国CDC标准，要因地制宜制定自己的判定标准；也说明国产试剂盒之间的检测性能有较大的异质性。需要继续加强对HCV NS3等蛋白的表达纯化和抗原性研究，努力提高试剂盒生产工艺，在提高特异抗体检出率的同时降低交叉反应。RIBA是HCV抗体检测的确认试验，由于其成本效益比缺乏足够的优越性等原因，RIBA一直没有在我国上市。

12、实际上，在亚太地区，由于经济发展的不平衡，很多国家都难以采用RIBA对HCV抗体检测进行确认，甚至难以重复检测。有鉴于此，2007年发布的亚太地区丙型肝炎专家共识指出，单次EIA检测S/CO达到预测真阳性的水平可报告为阳性，而单次EIA检测S/CO未达到预测真阳性的水平或接近S/CO值者应考虑HCV RNA定性检测和/或进一步获得样本进行HCV抗体和HCV RNA定性检测。我国可以参考该共识进行临床HCV抗体的检测和报告。同时，已有国产的HCV分片段抗体检测试剂问世，对于确认HCV抗体具有一定的价值。特别是近来已有国产的免疫印迹试剂，对于今后改变单一依赖HCV抗体S/CO比值报告的局面有较大的

13、帮助。相比NAT，HCV抗体检测还有几点局限性：（1）抗体产生是病毒感染的间接证据，不能区分是现症感染还是病毒已被清除；（2）感染HCV的免疫力低下患者（如移植患者）及血液透析者血清中抗体水平很低甚至不产生抗体，容易漏检；（3）相比RNA和抗原检测，从HCV感染到抗体出现的“窗口期”较长，虽然第三代抗体检测的窗口期已缩短为78周，但仍不能完全满足临床早期诊断和献血员筛查的要求。二、 HCV RNA定量检测：有待于进一步的标准化HCV RNA在感染1周内即可被检测到，比抗体出现早数周时间，直观地反映了病毒的存在，尤其在移植、HIV感染以及血液透析人群中，RNA检测常常作为HCV感染的主要确诊手段

14、。HCV RNA分定性检测和定量检测，定性检测的敏感度略高于定量检测；定量检测根据不同的原理，又分为实时荧光定量RT-PCR（如Roche Cobas Monitor HCV v2.0）、分支DNA（Bayer Versant HCV RNA v3.0）、转录介导扩增（TMA）及核酸序列依赖性扩增（NASBA）等，国内外临床实验室实时荧光定量PCR的使用占主导地位。国际上，近5年来HCV RNA检测有向全自动化发展的趋势，突出表现在核酸提取的自动化目前知名的核酸自动化提取平台有罗氏的MagNA Pure LightCycler和Cobas AmpliPrep，生物梅里埃的NucliSens e

15、asyMAG平台等。MagNA采用玻璃磁珠吸附分离样本中的核酸，COBAS AmpliPrep采用生物素化的特异性寡核苷酸探针结合核酸，核酸-探针复合体与亲和素化的磁珠（Dynabeads）结合和分离，NucliSens则是利用硫氰酸胍溶解蛋白释放核酸，核酸被硅颗粒吸附而得以分离纯化。相比手工提取，核酸提取的自动化降低了手工操作的时间，特别是降低了手工操作引起的误差及污染，提高了模板RNA的纯度，有助于控制检测结果的可重复性，适于大通量检测。罗氏Cobas AmpliPrep/Cobas Taqman 48系统将自动核酸提取平台Cobas AmpliPrep和自动PCR检测平台Cobas Ta

16、qman 48对接，可实现核酸提取PCR扩增/荧光信号检测结果分析的整体自动化。Sandres-Sauné6等报告，全自动化检测与传统的Roche HCV monitor v2.0相比，相关性良好（r=0.89，P<0.001），灵敏度达到15 IU/ml，线性范围更广（91 IU/ml 5370000IU/ml），批内变异仅为0.3%3.3%，批间变异为1.5%6.7%。可以预见，和酶免疫、化学发光免疫及电化学发光免疫检测的全面自动化一样，NAT自动化也是未来的发展趋势；临床检验的自动化将有力地推动临床检验的标准化。不过Chevaliez7等的研究表明，Cobas Ampli

17、Prep/Cobas Taqman 48对约15%的2型和30%的4型HCV RNA测定值偏低，可能系HCV 5非编码序列中的突变引起引物和探针结合力降低所致；血清的1/5稀释也会造成RNA水平0.6 log10的降低，需要引起临床实验室的注意。相比其他实验室检测如血清学检测，PCR依然是临床实验室最不易实现标准化的项目，因其所受的影响因素最多，从实验室来说，标本保存不当、核酸提取不当等可造成假阴性结果的出现，而扩增产物的污染和核酸提取中标本间的交叉污染又容易出现假阳性结果；从试剂盒上说，试剂厂家的标准来源不一，单位不统一（有使用copies/ml，也有使用IU/ml等），使得检测结果缺乏可比

18、性。本世纪初，卫生部临床检验中心开始对临床基因扩增检测实验室进行认证，相关技术人员通过理论和实验培训方能进行操作，标本的采集、运送、处理及污染防治等问题得以规范化，使得HCV定量检测质量有了很大提高，但标准化问题仍然是主要问题。2006年王露楠8等按照WHO标准物质的研制方法，以WHO国际标准品（NIBSC, 编号96/790）作为溯源物质，对经阴性血清稀释的阳性血清赋值，赋值后的血清冻干保存，编号为GBW (E) 090032，是国内第一个可溯源到国际标准的用于NAT的标准物质。标准物质的研发和应用有助于控制RNA提取和逆转录两个环节的质量、消除不同试剂和不同人员操作间的差异，有助于实现量值

19、溯源，使不同实验室、不同试剂的检测结果具有可比性，是实现HCV RNA检测标准化的核心9。该标准物质传递的室间质评物已在全国使用，对临床实验室检测结果的准确性起到了良好的促进作用，今后需进一步强化其在HCV RNA PCR室内和室间质量控制中的应用。是否应将HCV RNA检测强制应用于低危人群的筛查在亚太地区（包括我国）尚未达成共识，主要是由于NAT检测的成本-效益的矛盾尚未很好解决，另外NAT检测对仪器和操作的要求高，尚难满足大规模标本量和快速筛查的需要。为了节约成本和提高检测通量，2002年以来，欧美发达国家和日本开始将血清/血浆混合微池(mini-pool)NAT引入血液制品的筛查。Ei

20、ras10等采用FDA推荐的Cobas AmpliScreen HCV v2.0（Roche）对西班牙5个血液中心的1,015,482份血样（占34.1%的西班牙年总献血量）进行2248人份混合血清的RNA定量测定，检测到3份HCVRNA阳性但抗体阴性的血样，追踪发现3位患者在5个月之内全部出现HCV抗体；采用同样的方法，美国和日本报道HCV抗体阴性的献血员中RNA阳性的几率分别为1/23万和1/35万。我国献血人口基数大，HCV的感染率高于欧美和日本，因此用NAT筛查HCV抗体阴性的血液制品出现RNA阳性的数量要远大于其他国家，进行献血员NAT筛查也有更重要的意义，但目前为止尚无大规模的实验

21、数据供参考。据文献报道，HCV抗原检测敏感性与NAT接近，而成本和操作时间与HCV抗体检测类似，可能会有助于这一问题的彻底解决。三、 HCV抗原检测：取代NAT，前景广阔但道路漫长目前HCV抗原检测的主要为HCV核心蛋白。核心蛋白是组成HCV核衣壳的主要蛋白，含约190个氨基酸，各型HCV氨基酸序列高度保守，同源性大于95%。血清中HCV抗原含量很低，比HBsAg低23个数量级，所以对检测试剂的敏感度和特异性要求很高。2001年，强生ortho公司推出了世界上首个HCV抗原检测试剂盒Ortho Trak-C，试剂盒所使用的结合抗体和检测抗体分别使用2对不同的鼠抗人单抗，采用抗体夹心法检测核心抗

22、原，最新版本的Trak-C可测到1.5pg/ml的核心蛋白。由于检测前先要对血清中的抗原-抗体复合物进行解离并裂解病毒颗粒，所以该试剂盒检测的是总的核心抗原。雅培的Architect HCV核心抗原检测试剂盒则采用了微粒化学发光免疫法，实现了抗原检测的自动化11。核心抗原含量与RNA水平正相关，窗口期仅比NAT晚0.24d，而比抗体检测缩短58.2d，有较高的敏感性12-13。抗原检测有与抗体检测相似的优点：操作简便、耗时短、成本相对较低、对专用仪器依赖性小，同时又具备RNA检测的优点：窗口期短，能直观反应HCV的病毒载量，可用于抗病毒治疗监测，是很有前景的检测项目。但抗原检测亟待解决的问题是

23、提高敏感性，因为现有的抗原检测试剂在RNA 20,000 IU/ml以下时大多为阴性，会造成一定漏诊率；另外，灵敏度提高的同时亦需解决假阳性的问题，低于8.5pg/ml的样本假阳性率为100%13，需要以“中和试验”作为抗原检测确认试验，制定阈值S/CO。目前商品化的HCV检测试剂均尚未获得美国FDA认可。近两年来，HCV抗原-抗体联合检测试剂盒也已上市，例如Bio-Rad公司的Monolisa和雅培公司的Murex HCV抗原-抗体检测试剂盒。但上述两种抗原/抗体联合检测方法的灵敏度与NAT相比均存在较大差距，Tuke PW等报道142份抗体阴性血浆中，112份RNA阳性，但是只有56份Mu

24、rex阳性，32份Monolisa阳性，其敏感性有待进一步提高14。四、 HCV基因分型：如何向临床推广HCV根据序列间的差异可分为6种主要的基因型和更多的亚型（型和亚型分别以数字和小写字母表示），中国最主要的基因型为1b（66%），其次为2a（14%），还有其他型别如南方地区的6型等。不同基因型对抗病毒治疗的应答不同，采取的治疗方案也不同，对RNA定量结果也有一定的影响，因此对HCV进行基因分型有重要的临床意义。传统的HCV血清学分型与分子生物学分型相比，只有62.1%的符合率15，今后会逐渐被后者分型所取代。目前商品化的分型试剂的检测靶位点主要集中于保守的5端非编码区，如Bayer的Tru

25、gene HCV分型试剂盒和反相线性探针检测(LiPA)试剂盒，两者均通过了美国FDA认证。前者直接测序进行分型，LiPA则是基于反相杂交原理，PCR扩增目的基因（扩增的DNA被生物素标记），与硝酸纤维膜上线形区带上的寡核苷酸探针杂交，再加入标记有碱性磷酸酯酶的亲和素，与杂交产物上标记的生物素结合，加入显色底物NBT/BCIP孵育后，显现紫色或棕色的条带，不同的条带组合对应不同的基因型。相比第一代产品，二代LiPA HCV增加了核心区序列，可准确地区分1a和1b型，并可避免东南亚地区和我国南部地区较常见的6c-6l型误分为1型16，但仍约有8%的2a型易被LiPA误判为1a型17，这两种型别的

26、HCV感染的治疗和预后均存在较大差异。需要注意，不论是Trugene还是LiPA，均要经过PCR扩增，对HCV混合感染进行分型时，不可避免会因不同型别RNA扩增效率不一造成的劣势扩增毒株的漏检。目前HCV分型试剂盒的最大的问题是价格高昂，阻碍着这项技术的临床推广和应用。参考文献 Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 1989,244:359-362.2 Alter MJ

27、, Kuhnert WL, Finelli L; Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 2003, 52:1-13, 15.3 谷金莲,祁自柏,王尊文等. 丙型肝炎病毒抗体试剂检测结果的可信度分析. 中华检验医学杂志, 2005, 28:580-58

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29、essing. J Med Virol, 2007, 79:1821-6. 7 Chevaliez S, Bouvier-Alias M, Brillet R, et al. Overestimation and underestimation of hepatitis C virus RNA levels in a widely used real-time polymerase chain reaction-based method. Hepatology, 2007, 46:22-31.8 王露楠, 吴健民, 李金明, 等. 丙型肝炎病毒核酸检测的国家标准物质的研制. 中华检验医学杂志,

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