生化药物与基因工程药物分析

1、生化药物与基因工程药物分析 第一节第一节 概概 述述 第一节第一节 概概 述述 第一代生物药物：生物体某些第一代生物药物：生物体某些天然活性物质加工天然活性物质加工制成，例如胎盘制剂制成，例如胎盘制剂 第二代：利用生化技术从生物材料中第二代：利用生化技术从生物材料中分离、纯化分离、纯化获获得的，例如纯化胰岛素得的，例如纯化胰岛素 第三代：利用生物技术生产的天然生化物质及经过第三代：利用生物技术生产的天然生化物质及经过生物工程手段改造的新物质生物工程手段改造的新物质一、生物药物的概念一、生物药物的概念利用利用生物体、生物组织或器官等成分生物体、生物组织或器官等成分，综，综合应用生物学、生物化学、

2、微生物学、免疫学、合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制的的一类药物物理化学和药学的原理与方法制的的一类药物广义：从动物、植物、微生物等生物体中广义：从动物、植物、微生物等生物体中制取的各种天然生物活性物质以及人工合制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物成或半合成的天然物质类似物（一）生化药物： 利用生物化学的理论、方法和技术，从动物、利用生物化学的理论、方法和技术，从动物、植物以及微生物等生物体中提取分离的天然活植物以及微生物等生物体中提取分离的天然活性物质，以及这些物质及其衍生物的化学合成、性物质，以及这些物质及其衍生物的化学合成、半

3、合成和现代生物技术制的的产品。半合成和现代生物技术制的的产品。例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。（二）生物技术药物 生物技术：生物技术：利用生物体或其组成部分发展产品利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系，生物技术作为一种手段可用以研的技术体系，生物技术作为一种手段可用以研究和开发新药。究和开发新药。 生物技术药物（生物工程药物）：生物技术药物（生物工程药物）：用生物技术研用生物技术研制的药物制的药物（三）基因工程药物 先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制蛋白质合成过程的基因分离、质，然后将控制蛋白质合成

4、过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组纯化或进行人工合成，利用重组DNADNA技术加以改技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖或表达，并能进行大规模生产具有预防和治疗断繁殖或表达，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质这种疾病的蛋白质（四）生物制品 应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物或人源组织和体液等生物材料制备，用各种动物或人源组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病的

5、预防、治疗和诊断的药品。于人类疾病的预防、治疗和诊断的药品。生物制品的分类 预防：菌苗（卡介苗）、疫苗（乙肝疫苗）、类毒素预防：菌苗（卡介苗）、疫苗（乙肝疫苗）、类毒素（破伤风类毒素）（破伤风类毒素） 治疗：特异性治疗用品（狂犬病免疫球蛋白）、治疗：特异性治疗用品（狂犬病免疫球蛋白）、非特异性治疗用品（白蛋白）非特异性治疗用品（白蛋白） 诊断：免疫诊断用品（结核菌素）诊断：免疫诊断用品（结核菌素） 1. 1. 生物体的基本生化成分生物体的基本生化成分 来自生物体，参与、调控和影响人体代谢和生理功来自生物体，参与、调控和影响人体代谢和生理功能，在某些疾病治疗时具有针对性强、毒副作用小的能，在某些

6、疾病治疗时具有针对性强、毒副作用小的特点。部分蛋白质药物，极微量就可产生显著效果。特点。部分蛋白质药物，极微量就可产生显著效果。 2. 2. 分子量大分子量大: : 分子量一般为几千至几十万，结构复杂，甚至不确定，分子量一般为几千至几十万，结构复杂，甚至不确定，分析和检验困难，常需纯度分析和分子量测定。分析和检验困难，常需纯度分析和分子量测定。 二、药物治疗控制的特点二、药物治疗控制的特点 3. 3. 结构难确证：各种技术结构难确证：各种技术 4. 4. 全过程的质量控制：全过程的质量控制： 对酸、碱、热、对酸、碱、热、pHpH等敏感，严格控制实验条件和鉴定等敏感，严格控制实验条件和鉴定质量。

7、基因工程药物比传统工艺生产的药物要求更高。质量。基因工程药物比传统工艺生产的药物要求更高。 5. 5. 生物活性检查生物活性检查多肽、蛋白质类药物，除采用理化检验外，还需采用多肽、蛋白质类药物，除采用理化检验外，还需采用生物鉴定法证实其生物活性。生物鉴定法证实其生物活性。 二、药物治疗控制的特点二、药物治疗控制的特点 6. 6. 安全性检查安全性检查 热源检查、过敏实验、致突变实验热源检查、过敏实验、致突变实验 7. 7. 效价（含量）测定：效价（含量）测定： 理化法：生物药物和基因工程药物理化法：生物药物和基因工程药物 效价测定和活性测定：酶类药物效价测定和活性测定：酶类药物 二、药物治疗控

8、制的特点二、药物治疗控制的特点第二节 质量控制的项目和方法 来源和种类来源和种类 性状性状 鉴别鉴别 检查检查 含量测定含量测定 一、鉴别试验一、鉴别试验 理化鉴别法：化学鉴别法理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度法紫外分光光度法 HPLCHPLC法法生化鉴别法：酶法生化鉴别法：酶法 电泳法电泳法 样品脱盐后等电点聚焦法测定样品脱盐后等电点聚焦法测定生物鉴别法：血清学法生物鉴别法：血清学法 生物学法生物学法（一）（一）理化鉴别法理化鉴别法 1.1.化学鉴别法：化学鉴别法： 例：溶菌酶例：溶菌酶 +Cu+Cu2+ 2+ 络合显色络合显色 2.2.紫外分光光度法紫外分光光度法 最大吸收波长固定不变

9、，紫外光谱图一致最大吸收波长固定不变，紫外光谱图一致 溶剂：溶剂：0.01mol/L0.01mol/L盐酸盐酸例：三磷酸腺苷二钠例：三磷酸腺苷二钠 浓度：浓度：20g/ml20g/ml 判断：判断： maxmax：2572571nm1nm 3. HPLC3. HPLC法：法： 利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。时间和肽图谱的一致性进行鉴别。 （二）生化鉴别法（二）生化鉴别法1.1.酶法：酶法： 例：尿激酶的鉴别例：尿激酶的鉴别-气泡上升法气泡上升法 原理：原理： 方法：方法： 取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维取小试管

10、，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置37370.50.5恒恒温水浴保温，记时。反应系统在温水浴保温，记时。反应系统在30304040秒内凝结，秒内凝结，凝结块内有气泡生成，凝结块内有气泡生成，1515分钟内凝结块溶解，当凝分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%0.9%氯化钠作空白，氯化钠作空白，同法同法 操作，凝结块在操作，凝结块在2 2小时内不溶。小时内不溶。2. 2. 电泳法：电泳法：带电荷的供试品在惰

11、性支持介质中，与电场带电荷的供试品在惰性支持介质中，与电场的作用下，按各自的速度向其对应的电极方的作用下，按各自的速度向其对应的电极方向泳动，使组分分离成狭窄的区带。向泳动，使组分分离成狭窄的区带。2. 2. 电泳法：以肝素鉴别为例。电泳法：以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。3. 样品脱盐后等电点聚焦法测定样品脱盐后等电点聚焦法测定 基因工程药物等电点不一致基因工程药物等电点不一致 同一产品，不管有几个等电点，批与批之间必须同一产品，不管有几个等电点，批与批之间必须一致一致（三）生物鉴别法1.1.血清学法血清学法体外的抗原抗体试验。体外

12、的抗原抗体试验。经典血清学反应：经典血清学反应：凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应免疫扩散、免疫电泳以及荧光标记、酶标记等高敏免疫扩散、免疫电泳以及荧光标记、酶标记等高敏感的检测技术感的检测技术 2. 2. 生物法：生物法： 利用生物体进行试验来鉴别药物。利用生物体进行试验来鉴别药物。 例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。 利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS50%GS，惊厥停止。，惊厥停止。 一般杂质检查：氯化物、硫酸盐、

13、铵盐、一般杂质检查：氯化物、硫酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度等铁盐、重金属、酸度等特殊杂质检查：原料药纯度分析和生产过特殊杂质检查：原料药纯度分析和生产过程中杂质的检查程中杂质的检查二 杂质检查（二）特殊杂质检查1. 1.原料药的纯度分析原料药的纯度分析多糖类纯度分析：低聚糖及可能混入的核酸、蛋白质多糖类纯度分析：低聚糖及可能混入的核酸、蛋白质2. 2.生成过程中杂质的检查生成过程中杂质的检查有传统生产方法不可能存在的有害杂质，如内毒素、有传统生产方法不可能存在的有害杂质，如内毒素、致敏原致敏原生化药物和基因药物的含量表示方法：生化药物和基因药物的含量表示方法：百分含量：适用于结构明确的小分子

14、药百分含量：适用于结构明确的小分子药 物或经水解后变成小分子的物或经水解后变成小分子的 药物。药物。生物效价或酶活力单位：适用于酶类、生物效价或酶活力单位：适用于酶类、 蛋白质类药物。蛋白质类药物。三、含量（效价）测定三、含量（效价）测定第三节第三节 定量分析方法定量分析方法理化分析法理化分析法生化测定法生化测定法生物检定法生物检定法一、理化分析法（一）化学分析法（一）化学分析法 重量法：重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。测定所含成分的含量。 滴定分析法：滴定分析法：根据生物制品中某些成分能与标准溶根据生物制品中某些成分能与标准

15、溶液定量的发生酸碱中和反应、氧化还原反应等特性，液定量的发生酸碱中和反应、氧化还原反应等特性，通过滴定过程而进行生物制品的含量测定的方法通过滴定过程而进行生物制品的含量测定的方法（二）电化学分析法 电化学分析法：建立在物质在溶液中的电化学性质电化学分析法：建立在物质在溶液中的电化学性质基础上的一类仪器分析方法，通常将试液作为化学基础上的一类仪器分析方法，通常将试液作为化学电池的一个组成部分，根据该电池的某种电参数（电池的一个组成部分，根据该电池的某种电参数（如电阻、如电阻、电导电导、电位电位、电流电流、电量或电流、电量或电流- -电压电压曲曲线等）与被测物质的浓度之间存在一定的关系线等）与被测

16、物质的浓度之间存在一定的关系而进行测定的方法。而进行测定的方法。（三）光谱法1. 1.比色法比色法供试品中某些成分可与显色剂发生颜色反应，根据颜色供试品中某些成分可与显色剂发生颜色反应，根据颜色的深浅，与标准液进行同法处理后比较，即可测定含的深浅，与标准液进行同法处理后比较，即可测定含量。量。例：蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应例：蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应（三）光谱法2. 2.紫外分光光度法：生物制品或相关的反应产物的紫紫外分光光度法：生物制品或相关的反应产物的紫外光谱在某一特征波长处有最大吸收，且一定的浓外光谱在某一特征波长处有最大吸收，且一定的浓度范围内与相应的吸光度成正比，则可用于生

17、物制度范围内与相应的吸光度成正比，则可用于生物制品的含量测定品的含量测定（三）光谱法3. 3.荧光分光光度法：荧光分光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。该法灵敏度高(通常比紫外分光光度法高23个数量级)，选择性好。（四）高效液相色谱法 具有高效分析、灵敏检测、操作简便的优点具有高效分析、灵敏检测、操作简便的优点 分离过程中不破坏分离样品的特点分离过程中不破坏分离样品的特点 适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生物制品的定量分析差的生物制品的定量分析二、生化

18、分析法（一）酶法 以酶为分析对象的分析：酶活力测定法以酶为分析对象的分析：酶活力测定法目的是测酶的活性或活力目的是测酶的活性或活力 以酶为分析工具或分析试剂的分析方法：酶分析以酶为分析工具或分析试剂的分析方法：酶分析法法主要测定样品中酶以外其他物质的含量主要测定样品中酶以外其他物质的含量1 1）基本概念：）基本概念： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。 酶反酶反应速度可以用单位时间反应底

19、物的减少或产物的应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。增加来表示。1.酶活力测定法1 1）基本概念：）基本概念：酶单位：任何一种酶，在酶单位：任何一种酶，在2525以最适当的底物浓度以最适当的底物浓度、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pHpH等条件下等条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位（国际单位，单位（国际单位，IUIU） 1.酶活力测定法1 1）基本概念：）基本概念：酶的比活性酶的比活性：为每毫克蛋白质所具有的酶单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。 1.酶活力测定法

20、酶反应进程曲线酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量，纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。 2 2）酶促反应的条件及影响因素）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度底物的浓度：一般选用底物的浓度S=100KS=100Km m。 pHpH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、

21、：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的适宜的pHpH值的缓冲系统来控制值的缓冲系统来控制pHpH。 温度：酶反应的温度通常选用温度：酶反应的温度通常选用2525、3030或或 3737，实验中温度变动应控制在，实验中温度变动应控制在0.10.1以内。以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。相应的辅酶。3 3）测定方法：）测定方法：取样测定法、连续测定法取样测定法、连续测定法取样测定法：在酶反应开始后不同的时间，从反应取样测定法：在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其系统中取出一定量的反应液，

22、并用适当的方法停止其反应后，再根据底物和产物在化学性质上的差异，用反应后，再根据底物和产物在化学性质上的差异，用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。反应变化量的方法。连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续监测的方法。连续监测的方法。4 4）酶活力测定的方法）酶活力测定的方法检测方法：检测方法：紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 旋光法旋光法荧光分光光度法荧光分光光度法 电化学测定法电化学测定法 酶偶联测定法酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。离子选择性电极测定法

23、等。 2.2.酶分析法酶分析法 分析对象是酶的底物、辅酶活分析对象是酶的底物、辅酶活化剂、酶的抑制剂。化剂、酶的抑制剂。 1.1.动力学分析法动力学分析法 2.2.总变量分析法本法又称为平衡法总变量分析法本法又称为平衡法或终点法。或终点法。 仅适用于底物的测定。仅适用于底物的测定。（二）电泳法（二）电泳法 电泳法可分为三大类：自由界面电电泳法可分为三大类：自由界面电泳、区带电泳、高效毛细管电泳（泳、区带电泳、高效毛细管电泳（HPCE)HPCE)。根据所用支持物的不同分为：纸电泳根据所用支持物的不同分为：纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、法、醋酸纤维素薄膜电泳法、PAGEPAGE法法、SDS-PAGESDS-PAGE法、琼脂糖凝胶电泳法法、琼脂糖凝胶电泳法1 1、自由界面电泳：、自由界面电泳：在一根在一根U U形管里的溶液中，同种分子的构形管里