力达霉素通过诱导DR的表达促进TRAIL诱导的人非小细胞肺癌细胞凋亡

1、力达霉素通过诱导力达霉素通过诱导DR5的的表达促进表达促进TRAIL诱导的人诱导的人非小细胞肺癌细胞凋亡非小细胞肺癌细胞凋亡 杨杨 杰杰中国医学科学院中国医学科学院医药生物技术研究所医药生物技术研究所2010.5研研 究究 背背 景景 TRAIL是是TNF超家族成员之一，具超家族成员之一，具有有型跨膜蛋白的结构特点，分子量型跨膜蛋白的结构特点，分子量33-35 kD。TRAIL的细胞外部分可降解后形的细胞外部分可降解后形成可溶性成可溶性sTRAIL，无跨膜区和胞浆区，无跨膜区和胞浆区，具有生物学活性，且可以在体外重组表具有生物学活性，且可以在体外重组表达。达。研研 究究 背背 景景 TRAIL

2、可与存在于肿瘤细胞表面的死亡受可与存在于肿瘤细胞表面的死亡受体体DR4、DR5结合并活化形成三聚体，再募集结合并活化形成三聚体，再募集死亡结构域连接蛋白死亡结构域连接蛋白FADD（Fas associated death domain protein），），启动凋亡信号。启动凋亡信号。 FADD通过死亡效应结构域募集通过死亡效应结构域募集Pro-caspase8到到DR4和和DR5的受体复合物上，并将其剪切活化为活的受体复合物上，并将其剪切活化为活性性caspase8。从而激活相关的下游凋亡通路，。从而激活相关的下游凋亡通路，最终导致肿瘤细胞凋亡。最终导致肿瘤细胞凋亡。 TRAIL目前已经发展

3、到目前已经发展到期临床试验阶段，期临床试验阶段，它可以选择性地杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细它可以选择性地杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞胞, ,而正常细胞则通过表达诱骗受体等方式逃而正常细胞则通过表达诱骗受体等方式逃逸其杀伤作用逸其杀伤作用, ,这种特性使其具有应用于肿瘤这种特性使其具有应用于肿瘤治疗的巨大潜力。治疗的巨大潜力。研研 究究 背背 景景 许多肿瘤细胞对许多肿瘤细胞对TRAIL存在天然耐药，而且同一存在天然耐药，而且同一组织来源的肿瘤细胞对组织来源的肿瘤细胞对TRAIL的敏感性也不一致，的敏感性也不一致，克服克服TRAIL的天然耐药性将能促进的天然耐药性将能促进TRAIL应用应用于临床。

4、于临床。 人们对人们对TRAIL与多种其他抗肿瘤制剂联合用药做与多种其他抗肿瘤制剂联合用药做了大量的研究，结果表明这种联用是有效的。了大量的研究，结果表明这种联用是有效的。研研 究究 背背 景景 力达达霉素（LDM）是从从我国国湖北省潜江县县土壤中分离的一株链链霉菌（Streptomyces globisporus C-1027）代谢产谢产物中筛选筛选得到的一种种新的大分子烯烯二炔类炔类抗肿肿瘤抗生素，由一个发个发色团团和一个辅个辅基蛋白组组成。研研 究究 背背 景景 力达霉素主要抑制细胞力达霉素主要抑制细胞DNA合成，引起合成，引起 DNA单链和双链的断裂。是迄今已报道的活性单链和双链的断裂

5、。是迄今已报道的活性最强的大分子蛋白类抗肿瘤抗生素之一。目前最强的大分子蛋白类抗肿瘤抗生素之一。目前在中国正在进行在中国正在进行期临床试验的力达霉素在体期临床试验的力达霉素在体外对多种肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，在体外对多种肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，在体内对一些移植性小鼠肿瘤及移植于裸鼠的人体内对一些移植性小鼠肿瘤及移植于裸鼠的人体肿瘤均具有显著疗效。肿瘤均具有显著疗效。 研研 究究 背背 景景 ApoproteinGluThrAlaAla Pro Ala Phe Ser Val SerAlaProGlyLeuSerAspSerPheThrThrAlaThrSerCysGlyAlaAla A

6、la Gly Ser ValValSerValSer GlnGlySerTyrTyr Ile Ala GlnGlyAlaAsnGlyThr AlaGlnAspProSerGly Ala Ala SerPhe SerValPheArg Lys SerValAlaAlaThrAlaAspCysSer Gly ValTyrValProThrGlySerThrThrProGlyGluAsnLeuGlyCysLeu Ala ValAlaThrHisGlyAsn Ser GlyGlyLeuLeuAspPheGlyCysAlaPro ValAspClNH2OHOOOCH3OOCH2ONOOOH3CNCH3O

7、HCH3OHOHH3CChromophore 许多研究已经表明，损伤许多研究已经表明，损伤DNA的化疗药物能够调节死的化疗药物能够调节死亡受体的表达，从而促进细胞对死亡受体诱导的凋亡亡受体的表达，从而促进细胞对死亡受体诱导的凋亡更为敏感。更有研究表明，化疗药物是通过诱导更为敏感。更有研究表明，化疗药物是通过诱导DR4和（或）和（或）DR5的表达来促进的表达来促进TRAIL诱导的肿瘤细胞凋诱导的肿瘤细胞凋亡。亡。 LDM作为具有强杀伤作用的抗肿瘤抗生素，它与作为具有强杀伤作用的抗肿瘤抗生素，它与TRAIL联合作用于肿瘤细胞是否具有协同作用，以及相关联合作用于肿瘤细胞是否具有协同作用，以及相关的机

8、制又是怎样很值得我们去探究。的机制又是怎样很值得我们去探究。研研 究究 背背 景景（1 1）测定不同浓度的）测定不同浓度的TRAIL对人非小细胞肺癌对人非小细胞肺癌H460的增殖的增殖抑制作用抑制作用（2 2）测定不同浓度的）测定不同浓度的LDM对人非小细胞肺癌对人非小细胞肺癌H460的增殖的增殖抑制作用抑制作用（3 3）测定不同浓度的）测定不同浓度的LDM和和TRAIL联合对人非小细胞肺癌联合对人非小细胞肺癌H460的增殖抑制作用的增殖抑制作用1.1.MTT试验检测药物对细胞增殖试验检测药物对细胞增殖的影响的影响LDM和和TRAIL联合用药相互作用指数联合用药相互作用指数CDI值值 AB两药

9、合用时存活率两药合用时存活率 CDI = CDI = A药单用时存活率药单用时存活率 B药单用时存活率药单用时存活率CDI 1 ，两药有协同作用；两药有协同作用；CDI 0.7，两药有显著的协同作用。，两药有显著的协同作用。2. Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡荧光染色检测细胞凋亡 3. Annexin V-FITC/ PI染色结合流式细胞染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡仪检测细胞凋亡4. LDM与与TRAIL联用对联用对TRAIL诱导的细胞诱导的细胞凋亡信号通路相关蛋白的影响凋亡信号通路相关蛋白的影响 5. 不同浓度不同浓度LDM对对TRAIL受体受体DR4和和DR5表达的影响表

10、达的影响6. LDM不同作用时间对不同作用时间对TRAIL受体受体DR4和和DR5表达的影响表达的影响结结 论论 TRAIL对人非小细胞肺癌细胞系对人非小细胞肺癌细胞系H460细胞增殖的抑制细胞增殖的抑制作用作用 LDM对人非小细胞肺癌细胞系对人非小细胞肺癌细胞系H460细胞增殖的抑制作细胞增殖的抑制作用用 TRAIL与与LDM对人非小细胞肺癌细胞系对人非小细胞肺癌细胞系H460细胞具细胞具有显著协同抗肿瘤作用有显著协同抗肿瘤作用 。在合适的剂量下。在合适的剂量下LDM与与 TRAIL联合应用比单独用药具有更好的疗效，能显著联合应用比单独用药具有更好的疗效，能显著增强对肿瘤细胞的凋亡作用。增强对肿瘤细胞的凋亡作用。结结 论论 LDM与与TRAIL联合可使联合可使PARP的切割和的切割和Caspase-3及及 Caspase-8的激活显著增强，从而增强了单药的诱导凋的激活显著增强，从而增强了单药的诱导凋亡作用。亡作用。 LDM能够增