实验亲和层析纯化IgG

1、上次实验总结上次实验总结配基 特异性Protein A许多IgGs 的Fc 片断Protein G许多IgGs 的Fc 片断Antigen特异的抗体Anti-IgG特异免疫球蛋白抗体纯化配基类型 族特异性族特异性专一特异性二、实验原理二、实验原理用用 rProtein A Sepharose 分离分离IgGColumn: HiTrap Protein A FF结合缓冲液: 20 mM 磷酸钠, pH 7.0洗脱缓冲液: 0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 3注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中二、实验原理二、实验原理种属种属蛋白蛋白 A 蛋

2、白蛋白 G结合结合结合结合人人IgA可变的可变的-IgD - -IgEIgG1 + +IgG2 + +IgG3 -+IgG4+ +IgM* 可变的可变的-鸟类蛋黄鸟类蛋黄IgY- -牛牛 + +狗狗 + +山羊山羊 - +豚鼠豚鼠IgG1 + +IgG2 + +仓鼠仓鼠 + +马马 + +考拉考拉 - +骆驼骆驼 - +种属种属蛋白蛋白 A 蛋白蛋白 G结合结合结合结合恒河猴恒河猴 + +大鼠大鼠IgG1 + +IgG2a + +IgG2b + +IgG3 + +IgM* 可变的可变的 -猪猪 + +兔兔 + +小鼠小鼠IgG1 - +IgG2a - +IgG2b - +IgG3 + +绵羊绵

3、羊 +/- + 相对结合强度相对结合强度 弱或不结合弱或不结合缓冲液： 平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.2；(1L) 冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mM EDTA二钠，pH7.2；(1L) 洗脱液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L) 清洗液：6mM氢氧化钠。(1L)稀释血清： 取2ml血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。标记为S.浓缩胶浓缩胶（5 ml）双蒸水双蒸水0.5 mol/L pH 6.8Tris-HCl30%胶胶贮液贮液10% SDSTEMED 10% AP5%3.4ml0.63 ml0.83ml50 l5

4、 l50 l分离胶分离胶（10 ml）双蒸水双蒸水1.5 mol/L pH 8.8Tris-HCl胶贮液胶贮液10% SDSTEMED10% AP7.5%12%10%4.8ml3.3ml4.0ml2.5ml2.5 ml2.5ml2.5ml4 ml3.3 ml100 l100 l100 l10 l10 l10 l100 l100 l100 l01234567100ug/ml牛血清蛋白标准液(ml) 0.20.40.60.81.0 样品待测液(ml) 0.50.5蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.2 0.50.5考马斯亮蓝G-2505.05.05.05.05.05.05.05.0各管均匀，室温下放置5分钟，在=595n处比色吸光度（OD595） 蛋白质含量（ug）020406080100 A595 标准曲线的制作和样品的测定将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至于白色背