第1节一级菌种制作技术

1、食用菌栽培学食用菌栽培学2007年年9月月生物技术教研室制种技术一级菌种制作技术 一级菌种制作一级菌种制作v一级菌种制作概述v一级菌种培养基的制备v一级菌种培养基的灭菌v菌种分离v菌种的纯化v菌种培养和保藏v一级菌种的质量鉴定一级菌种制作技术一级菌种制作技术 概述概述 一、概述一、概述 1 1概念概念 一级菌种是第一次用孢子分离法、组织分离法或基一级菌种是第一次用孢子分离法、组织分离法或基内菌丝分离法获得的纯菌丝体及其经过转管扩大后的菌内菌丝分离法获得的纯菌丝体及其经过转管扩大后的菌丝体。丝体。 2 2用途及要求用途及要求 一级菌种是菌种生产的基础，一级菌种质量的优劣，一级菌种是菌种生产的基础

2、，一级菌种质量的优劣，直接关系到二级菌种和三级菌种的质量，对食用菌生产直接关系到二级菌种和三级菌种的质量，对食用菌生产产生根本的影响。产生根本的影响。 3 3、制种过程、制种过程 一级菌种的制作过程，主要包括下列几个程序：一级菌种的制作过程，主要包括下列几个程序： 培养基的配制培养基的配制培养基的灭菌培养基的灭菌菌种的分离菌种的分离纯化纯化（提纯）（提纯）转管扩大转管扩大培养培养一级菌种一级菌种 一级菌种制作技术一级菌种制作技术 一级菌种培养基的配制一级菌种培养基的配制 （一）基本要求（一）基本要求 营养成分：必须营养全面且易于吸收。营养成分：必须营养全面且易于吸收。 容器：一级菌种培养基通常

3、用玻璃试管作容器，按容器：一级菌种培养基通常用玻璃试管作容器，按不同的配方加上琼脂凝固剂，制成琼脂斜面培养基，又不同的配方加上琼脂凝固剂，制成琼脂斜面培养基，又叫斜面培养基，简称斜面。叫斜面培养基，简称斜面。 （二）一级菌种培养基常用的材料（二）一级菌种培养基常用的材料 在配制一级菌种培养基时，选用的原材料要具备以在配制一级菌种培养基时，选用的原材料要具备以下二个条件：一是要能满足食用菌的营养需要；二是所下二个条件：一是要能满足食用菌的营养需要；二是所用原材料来源广，成本低。用原材料来源广，成本低。 琼脂（又称洋菜）是一级菌种培养基常用的凝固剂琼脂（又称洋菜）是一级菌种培养基常用的凝固剂 一级

4、菌种制作技术一级菌种制作技术 一级菌种培养基的配制一级菌种培养基的配制（三）一级菌种培养基常用的配方（三）一级菌种培养基常用的配方1 1常用配方常用配方 PDAPDA培养基培养基 PSAPSA培养基培养基马铃薯（去皮）马铃薯（去皮） 200g 200g 马铃薯（去皮）马铃薯（去皮） 200200g g葡萄糖葡萄糖 20g 20g 蔗糖蔗糖 2020g g琼脂琼脂 181823g 23g 琼脂琼脂 18182323g g水水 1000ml 1000ml 水水 10001000mlml一级菌种制作技术一级菌种制作技术 一级菌种培养基的配制一级菌种培养基的配制 （三）一级菌种培养基常用的配方（三）一

5、级菌种培养基常用的配方 2 2一级菌种培养基配方设计一级菌种培养基配方设计 组成一级种培养基的材料大致可分为四种：组成一级种培养基的材料大致可分为四种： 天然的有机物：应选择新鲜、无霉味、无虫蛀、无变质的优天然的有机物：应选择新鲜、无霉味、无虫蛀、无变质的优质材料，经热浸提后取滤液入料，为食用菌生长提供全面的营养。质材料，经热浸提后取滤液入料，为食用菌生长提供全面的营养。 可溶性的有机营养制剂：主要是为食用菌生长提供优质的碳可溶性的有机营养制剂：主要是为食用菌生长提供优质的碳源和氮源，要求纯度高，保藏良好。源和氮源，要求纯度高，保藏良好。 矿物质：多在改良培养基或综合培养基中作为食用菌对矿物矿

6、物质：多在改良培养基或综合培养基中作为食用菌对矿物质需求的补充剂，同时对培养基物理性状的改良起重要作用。其用质需求的补充剂，同时对培养基物理性状的改良起重要作用。其用量为量为0.01%0.01%0.5%0.5%。 琼脂：是固化培养基最常用的凝固剂，一般用量为琼脂：是固化培养基最常用的凝固剂，一般用量为2%2%。 一级菌种制作技术一级菌种制作技术 一级菌种培养基的配制一级菌种培养基的配制 （四）（四）一级菌种培养基的配制一级菌种培养基的配制 一级菌种培养基配方较多，原料较多，但制作方法大致相同。一级菌种培养基配方较多，原料较多，但制作方法大致相同。 平板培养基的制作平板培养基的制作 平板培养基常

7、用于单孢分离，测定菌丝生长速度，观察菌落平板培养基常用于单孢分离，测定菌丝生长速度，观察菌落的形态，拮抗实验，测定接种空间杂菌数。的形态，拮抗实验，测定接种空间杂菌数。 制作方法：制作方法： 将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。高压灭菌或干燥灭包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。高压灭菌或干燥灭菌后备用。菌后备用。 取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，略打开灭菌过的培养皿盖（露一小缝），倒入培养基（厚度为略打开灭菌过的培

8、养皿盖（露一小缝），倒入培养基（厚度为0.5cm0.5cm），封盖、冷凝，倒置备用。），封盖、冷凝，倒置备用。 一级菌种制作技术一级菌种制作技术 一级菌种培养基的灭菌一级菌种培养基的灭菌 （一）消毒与灭菌的概念（一）消毒与灭菌的概念 灭菌：是应用物理和化学方法杀灭物品表面和灭菌：是应用物理和化学方法杀灭物品表面和内部所有的微生物，是一种彻底的灭菌方法。内部所有的微生物，是一种彻底的灭菌方法。 消毒消毒：是应用物理和化学方法使欲消毒的物品：是应用物理和化学方法使欲消毒的物品表面和孔隙内绝大部分微生物致死，是一种不彻底表面和孔隙内绝大部分微生物致死，是一种不彻底的灭菌方法。的灭菌方法。 一级菌种制

9、作技术一级菌种制作技术 一级菌种培养基的灭菌一级菌种培养基的灭菌（二）（二）消毒与灭菌的方法消毒与灭菌的方法1 1、常用的灭菌方法、常用的灭菌方法火焰灭菌用于金属器具，火焰灼烧至红（在火焰2/3处烧）干燥箱灭菌用于玻璃器皿（培养皿、试管、三角瓶、吸管）等。洗净晾干包装放入干燥箱升温160170，保持12h 关闭电源，自然降温60以下打开干燥箱取出灭菌物品，尽快使用。干热灭菌湿热灭菌常压灭菌间歇灭菌第一次蒸，100保持1 h 28-37下培养24 h 第二次蒸，100，保持1 h 培养24 h 第三次蒸，100，保持1 h。不常用的原因：灭菌一锅需要34天时间，且冬天需要保温。持续灭菌蒸，100

10、保持1214 h（方法：攻头，控中间，保尾）。普遍采用，特别用于大规模塑料袋制种和塑料栽培筒的灭菌。注意：常压灭菌锅要设计合理，主要是灭菌彻底与否、燃料费用、周转速度、劳动强度、污染率的高低，直接影响经济效益。高压灭菌手提式高压灭菌锅：用于一级菌种培养基灭菌。卧式或立式高压灭菌锅：用于二、三级菌种培养基灭菌。一级菌种制作技术一级菌种制作技术 一级菌种培养基的灭菌一级菌种培养基的灭菌（二）消毒与灭菌的方法（二）消毒与灭菌的方法 2 2、常用的消毒方法、常用的消毒方法 空间消毒药液喷雾药剂薰蒸紫外线照射0.25%的新洁尔灭，5%的石碳酸，0.25%的多菌灵等。用量不小于30ml/m3；雾粒越细越好

11、；适时更换药液（防止抗药性）。1020ml的甲醛+58g的高锰酸钾/ m3；气雾消毒盒，26g/ m3；照30min后，再过30min开照明灯器具消毒药液浸泡煮沸消毒75%的酒精；药物揩擦煮沸20min以上培养料消毒熟石灰拌料；杀菌剂拌料（0.1%0.2%的多菌灵）；巴氏消毒（发酵）分离材料消毒75%的酒精棉球擦拭；0.1%升汞浸泡0.51min无菌水冲洗3次无菌纸吸干一级菌种制作技术一级菌种制作技术 一级菌种培养基的灭菌一级菌种培养基的灭菌 （三）一级菌种培养基的灭菌（三）一级菌种培养基的灭菌 1 1灭菌设备：手提式高压灭菌锅灭菌设备：手提式高压灭菌锅 2 2具体灭菌要求：具体灭菌要求：1.

12、1kg/cm21.1kg/cm2，121121，保持，保持20302030minmin。 3 3操作过程操作过程 加水加水装锅装锅盖盖盖盖加热加热当压力升为当压力升为0.5kg/cm20.5kg/cm2时排放冷空气时排放冷空气正式升压正式升压保压（保压（1.1kg/cm21.1kg/cm2，121121，保持保持20-3020-30minmin）停止加热停止加热自然降压至零自然降压至零排放余汽排放余汽开盖开盖取出灭菌物品取出灭菌物品趁热摆斜面趁热摆斜面检验灭菌效果检验灭菌效果（3232空白培养空白培养4848h h）。）。 一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离 （一）菌种分离的概

13、念（一）菌种分离的概念 菌种分离：用无菌操作的方法将所需要的食用菌从菌种分离：用无菌操作的方法将所需要的食用菌从混杂的微生物群体中单独分离出来的过程。混杂的微生物群体中单独分离出来的过程。 通过菌种分离得到的纯菌丝体即为一级菌种。通过菌种分离得到的纯菌丝体即为一级菌种。 （二）菌种分离的关键（二）菌种分离的关键 严格按无菌操作规程进行严格按无菌操作规程进行 无菌操作：任何一个操作过程都要注意避免把其它无菌操作：任何一个操作过程都要注意避免把其它任何无关的菌体带入到培养基中。注意二点：任何无关的菌体带入到培养基中。注意二点：1 1严格严格树立无菌观念；树立无菌观念；2 2严格遵循无菌操作规程。严

14、格遵循无菌操作规程。一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离 （三）菌种分离的设备（三）菌种分离的设备 1接种箱：操作规程接种箱：操作规程 2净化工作台：操作规程净化工作台：操作规程 3接种室：操作规程接种室：操作规程 一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级

15、菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级

16、菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种分离菌种分离一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的纯化菌种的纯化 一级菌种的纯化：是指对分离获得的菌种进行一级菌种的纯化：是指对分离获得的菌种进行再提纯，成为生产所需要的菌种的方法。再提纯，成为生产所需要的菌种的方法。 1 1菌丝的再提纯菌丝的再提纯 再提纯时，可选用菌落生长速度较为一致的再提纯时，可选用菌落生长速度较为一致的菌丝体作为再提纯对象，用消毒的接种铲切取菌菌丝体作为再提纯对象，用消毒的接种铲切取菌丝的前端部分（连同培养基一起），转移到新的丝的前端部分（连同培养基一起），转移到新的培养基上培养。如果菌丝生长稀疏，也

17、可采用单培养基上培养。如果菌丝生长稀疏，也可采用单根菌丝分离法。经过几次的切割移植，逐渐挑选根菌丝分离法。经过几次的切割移植，逐渐挑选生长良好的无杂菌菌株，从而获得纯菌种。生长良好的无杂菌菌株，从而获得纯菌种。 一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的纯化菌种的纯化 2 2污染物的排除污染物的排除 在菌种分离后，细菌、霉菌的污染时有发生，必须加在菌种分离后，细菌、霉菌的污染时有发生，必须加以排除。以排除。 一般来讲，被杂菌污染的菌株不再使用。但有时由于一般来讲，被杂菌污染的菌株不再使用。但有时由于菌种紧缺，并且污染物不多，也可用灭菌滤纸浸在菌种紧缺，并且污染物不多，也可用灭菌滤纸浸在1 1的的

18、多菌灵溶液中，然后取出覆盖于霉菌的生长点上，以防止多菌灵溶液中，然后取出覆盖于霉菌的生长点上，以防止分生孢子的扩散，然后用接种铲切取一小块远离杂菌的健分生孢子的扩散，然后用接种铲切取一小块远离杂菌的健壮菌丝移至新的斜面培养基上培养。如果是细菌污染，细壮菌丝移至新的斜面培养基上培养。如果是细菌污染，细菌的菌落比较局限，并不会出现细胞飞扬现象，因此，可菌的菌落比较局限，并不会出现细胞飞扬现象，因此，可以先用接种铲将细菌菌落连同培养基一起取出来，再从无以先用接种铲将细菌菌落连同培养基一起取出来，再从无菌部位取菌丝块转管一次，同样可以获得纯菌种。菌部位取菌丝块转管一次，同样可以获得纯菌种。一级菌种制作

19、技术一级菌种制作技术 出菇鉴定（试验）出菇鉴定（试验） 概念：概念：是菌种投入生产前必须做的结实性是菌种投入生产前必须做的结实性鉴定试验。鉴定试验。 目的：目的：进一步确定菌种，以避免菌种选育进一步确定菌种，以避免菌种选育不当而造成不可估量的损失。不当而造成不可估量的损失。 内容：内容：包括生产性状、商品性状、遗传性包括生产性状、商品性状、遗传性状三个方面。状三个方面。 一级菌种制作技术一级菌种制作技术 扩大培养（转管）扩大培养（转管） 一级菌种的扩大培养是在试管间进行的，因此又叫转管。一级菌种的扩大培养是在试管间进行的，因此又叫转管。 转管原因：从外地购进或分离获得的母种数量有限，不能满足生

20、产的需要转管原因：从外地购进或分离获得的母种数量有限，不能满足生产的需要时，要对初次获得的母种进行扩大繁殖，以增加母种数量。时，要对初次获得的母种进行扩大繁殖，以增加母种数量。 转管数量：一支母种可接转管数量：一支母种可接15152020支试管斜面，扩大的数量根据实际情况而支试管斜面，扩大的数量根据实际情况而定。定。 注意事项：母种的扩大繁殖不可无限制地移代，移代过多菌种生活力减弱，注意事项：母种的扩大繁殖不可无限制地移代，移代过多菌种生活力减弱，从而影响大面积栽培的生产效益。从而影响大面积栽培的生产效益。 操作过程：操作过程： (1) (1) 左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长

21、好的菌种。左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长好的菌种。右手拿接种钩右手拿接种钩( (已在火焰上灼烧灭菌又冷却已在火焰上灼烧灭菌又冷却) )，并同时用右手轻轻拔下两支，并同时用右手轻轻拔下两支试管的棉塞或试管帽。试管的棉塞或试管帽。 (2) (2) 将试管口通过火焰数次，并稍转动，以防环境中的微生物落入。将试管口通过火焰数次，并稍转动，以防环境中的微生物落入。 (3) (3) 首先将接种钩伸入有菌试管，连同培养基钩取直径为首先将接种钩伸入有菌试管，连同培养基钩取直径为3 35mm5mm的菌的菌丝块，取出接种钩，迅速伸入另一灭菌斜面上并将菌丝块放在斜面的中央。丝块，取出接种钩，迅速伸

22、入另一灭菌斜面上并将菌丝块放在斜面的中央。 (4) (4) 烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，如用胶塞，则不要烧试管口。烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，如用胶塞，则不要烧试管口。将接种钩烧一下，插到酒精瓶中。将接种钩烧一下，插到酒精瓶中。 一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的培养、保藏菌种的培养、保藏 （一（一) )培养培养 培养条件：培养条件：2525左右、干净、干燥、黑暗、通风左右、干净、干燥、黑暗、通风 培养设备：培养设备：电热恒温培养箱电热恒温培养箱 （二）保藏（二）保藏 1 1菌种保藏的目的：菌种保藏的目的：菌种由于传代次数过多，培养时间过长，或因不利菌种由于传代次数过多，培养时间

23、过长，或因不利的外界环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。因此，的外界环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。因此，在一定的时间范围内要使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，在一定的时间范围内要使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就必须采用相应的措施，做好菌种保藏工作。就必须采用相应的措施，做好菌种保藏工作。 2 2菌种保藏（概念）：菌种保藏（概念）：是创造一个特定环境条件，降低菌种的代谢活动，是创造一个特定环境条件，降低菌种的代谢活动，使其处于休眠状态，在一定的保藏时间内保持原有的优良性状，防止菌种使其处于休眠状态，在一定的保藏时间内保持原有的优良

24、性状，防止菌种退化，降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，而当使用时，提供合适的条退化，降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，而当使用时，提供合适的条件，能重新恢复正常生长繁殖。件，能重新恢复正常生长繁殖。 3 3菌种保藏的原理：菌种保藏的原理：是采用干燥、低温、冷冻或减少氧气供给等方法，是采用干燥、低温、冷冻或减少氧气供给等方法，降低菌种的代谢强度，终止其繁殖，并保证原来菌种的纯度。降低菌种的代谢强度，终止其繁殖，并保证原来菌种的纯度。 4 4传统的保藏方法：传统的保藏方法：有继代培养低温保藏法，矿油保藏法，冷冻干燥保有继代培养低温保藏法，矿油保藏法，冷冻干燥保藏法，液态氨超低温保藏法等。藏法，液态

25、氨超低温保藏法等。一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的保藏菌种的保藏一级菌种制作技术一级菌种制作技术 菌种的培养、保藏菌种的培养、保藏继代低温保藏法继代低温保藏法 食用菌在适宜的温度范围内，温度越高菌丝的代谢能力越强，菌种越食用菌在适宜的温度范围内，温度越高菌丝的代谢能力越强，菌种越容易衰老。容易衰老。低温保藏就是将培养好的菌株放在冰箱中低温保藏，降低其代低温保藏就是将培养好的菌株放在冰箱中低温保藏，降低其代谢强度，延长菌种的生活力。同时也防止空气中的杂菌污染。谢强度，延长菌种的生活力。同时也防止空气中的杂菌污染。 继代低温保藏的