发酵工业原料及其处理

1、第三章第三章 发酵工业原料及其处理发酵工业原料及其处理培养基培养基培养基是指人工配制的供微生物或动植物细胞生长、繁殖、代谢和合成各种产物的营养物质和原料。同时，培养基也为微生物等提供除营养外的其它生长所必须的环境条件。培养基的组成和配比对菌体的生长、产物的合成、提取工艺的选择、产品的质量和产量都有重要影响。 发酵工业原料的种类和成分淀粉水解糖的制备培养基的设计和优化发酵培养基灭菌第一节第一节发酵工业原料的种类和成分发酵工业原料的种类和成分培养基的类型和用途发酵培养基中各种成分的定量工业上常用作碳源的淀粉质原料工业上常用作氮源的蛋白质类原料发酵培养基中的无机盐和生长因子前体物质和促进剂、抑制剂一

2、、一、培养基的类型和培养基的类型和用途用途按来源分按培养基外观的物理状态分按功能分见p451. 按来源分按来源分天然培养基合成培养基半合成培养基2. 按培养基外观的物理状态分按培养基外观的物理状态分 适用于菌种分离、保藏、鉴定、杂菌检验等，也广泛应用于真菌的生产，如霉菌、香菇、白木耳等。 常用组分：麸皮、大米、小米、木屑、琼脂等。固体培养基 即在液体培养基中加入0.20.8%的琼脂。 主要用于观察微生物的运动特征，噬菌体效价等。半固体培养基 适用于大规模工业生产及基础理论的实验室研究工作。液体培养基3、按功能分、按功能分孢子培养基：供菌种繁殖孢子的固体培养基。 使菌体生长迅速，产生较多优质的孢

3、子，并不易引起菌种变异。种子培养基：供孢子发芽、菌体繁殖的培养基。 增加细胞数量，并培养出强壮、活力强的细胞。发酵培养基：供菌种生长繁殖和合成产物的培养基。 既能使菌体生长迅速，又能使菌体能迅速合成大量产物。见p46和p50（1）孢子培养基）孢子培养基常用的有麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米培养基和肉汤培养基等。碳源、氮源含量不要太丰富，特别是有机氮源。含有生长素和微量元素，有利于孢子大量形成。注意培养基的pH值和湿度。（2）种子培养基）种子培养基营养相对丰富、完全，氮源和维生素含量要高些。要能维持稳定的pH。最后一级种子培养基的成分应该能接近发酵培养基。二、二、发酵培养基中各种成分的

4、发酵培养基中各种成分的定定量量组成应丰富、完全。要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH值。除有菌体生长所需的元素和化合物外，还要有产物合成所需的元素、前体和促进剂等。可以考虑采用分批补料方式。1. 碳源碳源功能 提供合成细胞结构物质所需碳元素。 提供目的产物中的碳。 合成产物的能源。常用碳源 淀粉（starch）、淀粉水解糖（starch sugar）、糖蜜（molasses）、有机酸（organic acid）、低碳醇、脂质、烃类等。2. 氮源氮源功能 提供合成细胞结构物质所需氮元素。 提供目的产物中的氮。常用碳源 有机氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、

5、发酵菌丝体、酒糟等。 无机氮源：氨水、液氨、尿素、硝酸盐、铵盐等。3. 无机盐无机盐对菌体生长和产物合成都十分重要。不同发酵对不同种类无机盐的需求不同。4. 生长因子生长因子发酵培养基中必不可少，但在某些发酵中生长因子的量要控制适当。5. 前体前体某些化合物加入到发酵培养基中，能直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身的结构并未发生太大变化，却能提高产物的产量，这类小分子物质称为前体。来源： 有的是菌体本身能够合成的，如青霉素前体缬氨酸和半胱氨酸； 有的菌体不能合成或合成很少，需要从外界加入，如青霉素V前体苯氧乙酸。前体使用的浓度要适当，一般采取流加方式。6. 促进剂促进剂既不是营养物质

6、，又不是前体，但这类物质的加入能提高产物产量，这类物质称为促进剂。功能： 影响微生物的正常代谢； 促进中间代谢产物的积累； 提高次级代谢产物的产量。促进剂专一性很强，用量极微，效果显著。需要通过试验选择品种，确定用量。7. 抑制剂抑制剂发酵培养基中加入抑制剂，可以抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致改变微生物的代谢途径，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累。抑制剂专一性很强，用量极微，效果显著。需要通过试验选择品种，确定用量。三、三、工业上常用作碳源的淀粉质工业上常用作碳源的淀粉质原料原料淀粉淀粉质原料1. 淀粉淀粉来源于各种植物组织。直链淀粉：葡萄糖经-1

7、,4糖苷键脱水缩聚而成螺旋形不分支长链，聚合度1006000，相对分子量1105。 热水溶解：形成黏度较低的不稳定胶体溶液。 与碘反应：呈蓝色。支链淀粉：直链部分的葡萄糖以-1,4糖苷键连接，分支点上的葡萄糖以-1,6糖苷键连接，聚合度100030000，相对分子量6106。 热水溶解：形成糊状物。 与碘反应：呈红到紫红色。2. 淀粉质原料淀粉质原料工业淀粉：以谷类、薯类等农产品为原料加工而成，白色或微带浅黄色阴影的粉末。 常用的有玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉等。谷类：包括大米、高粱、大麦、小麦等。薯类：甘薯、马铃薯、木薯为主。李江华，无锡轻工大学学报，2004(1.5g麸皮)嗜碱

8、芽孢杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型苏勤，林业化学与工业，2004四、四、工业上常用作氮源的蛋白质类工业上常用作氮源的蛋白质类原料原料有机氮源无机氮源1. 有机氮源有机氮源黄豆饼粉：广泛用于抗生素发酵。 全脂黄豆粉：油脂18%。 低脂黄豆粉：油脂9%。 脱脂黄豆粉：油脂2%。主要成分： 蛋白质：脱脂 低脂 全脂； 油脂：脱脂低脂全脂； 灰分：脱脂 低脂 全脂； 水分：脱脂低脂全脂。玉米浆玉米浆是玉米淀粉生产中的副产物，是用亚硫酸浸泡玉米所得的浸泡液的浓缩物。其中固体物含量在50%以上。成分：含有丰富的氨基酸、还原糖、生物素等

9、。较多的有机酸，如乳酸，因此其pH在4左右。硫、磷、微量元素等。2. 无机氮源无机氮源特点：微生物对它们的吸收利用快。无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。 使用意义：满足菌体生长。稳定和调节发酵过程的pH。无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质。(NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵。生理碱性物质：若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。氨水氨水作用：易利用的氮源。调节pH值。使用方法：

10、使用前应进行过滤除菌。使用时要加强搅拌，防止局部过碱，并少量多次加入。例：无机氮源对毛霉产蛋白酶的影响例：无机氮源对毛霉产蛋白酶的影响效果：硫酸铵效果：硫酸铵 硝酸铵硝酸铵 硝酸钠硝酸钠 尿素尿素陈涛，中国酿造，2004五、五、发酵培养基中的无机盐和生长发酵培养基中的无机盐和生长因子因子1. 磷酸盐功能： 磷是某些蛋白质和核酸的组成成分； ADP、ATP是重要的能量传递物质，参与一系列的代谢反应； 磷酸盐有缓冲作用。微生物对磷的需要量一般为0.0050.01mol/L。黑曲霉黑曲霉NRRL-330生产生产-淀粉酶，淀粉酶， P对酶对酶活的影响活的影响 pH酶活不加 4.25120min加 K2

11、HPO4 5.4530min加 KH2PO4 4.6275min2. 硫酸镁硫酸镁功能： 镁是许多重要的酶的激活剂； 硫为菌体合成含硫蛋白质提供硫源。MgSO47H2O是发酵工业中常用的无机盐。3. 钾盐钾盐微生物需钾量一般约为0.1g/L（以K2SO4计）。 当培养基中磷盐配用1g/L K3PO43H2O时，同时提供了钾，钾浓度为0.38g/L； 当培养基中磷盐配用1g/L Na2HPO412H2O时，应另外配用KCl 0.30.6g/L，钾浓度为0.350.7g/L。4、生长因子（生长素）、生长因子（生长素）从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等

12、均称生长因子。来源：有机氮源。六、前体六、前体物质和促进剂、物质和促进剂、抑制剂抑制剂1. 前体 有些氨基酸、抗生素和核苷酸发酵中必须添加前体。产物产物前体前体产物产物前体前体青霉素G苯乙酸等维生素B12钴化物青霉素O烯丙基-巯基乙酸丝氨酸甘氨酸青霉素V苯氧乙酸色氨酸吲哚、氨茴酸链霉素肌醇，精氨酸等蛋氨酸2-羟基-4-甲基硫代丁酸金霉素氯化物异亮氨酸D-苏氨酸红霉素丙酸、丙醇等苏氨酸高丝氨酸灰黄霉素氯化物 青霉素G：分子量356苯乙酸:分子量136使用方法使用方法普遍采用流加方法。前体一般都有毒性。如苯乙酸，一般仅仅添加0.07%。前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化。流加也有利于提

13、高前体的转化率。2. 促进剂促进剂某些氨基酸、抗生素和酶制剂生产中添加促进剂。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的：有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，增强氧的传递，从而促进酶的分泌与生产；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂可以沉淀或螯合有害的重金属离子。3. 抑制剂抑制剂有些抑制剂可抑制某些代谢途径的进行，而使代谢向所需产物的途径转化，常用于抗生素和有机溶剂发酵。氯霉素、植酸、草酸等能抑制噬菌体的繁殖，可用于氨基酸发酵。 RR1R2R3四环素(TC)HOHCH3H金霉素(CTC)ClOHCH3H土霉素(OTC)HOHCH3

14、OH例：四环素生产中，加入溴化钠，能抑制金霉素的形成，促进四环素的生成。第二节第二节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备方法水解糖液的质量要求一、淀粉水解糖的制备方法一、淀粉水解糖的制备方法将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。所制得的糖液称为淀粉水解糖。淀粉水解糖成分： 主要是葡萄糖，少量的麦芽糖等复合二糖、低聚糖。 原料中的杂质（如蛋白质、脂肪）及其分解产物即氨基酸、脂肪酸。淀粉水解糖广泛应用于氨基酸、抗生素、有机酸、多糖、甾体转化等生产中。见P56淀粉糖化的方法淀粉糖化的方法酸水解法（酸糖化法）：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。酶水解

15、法（双酶法）：利用液化酶和糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的方法。液化：用液化酶使糊化淀粉水解为糊精及低聚糖。糖化：用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解为葡萄糖。酸酶结合水解法酸酶（水解）法：先以酸为催化剂将淀粉水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶将其水解成葡萄糖。酶酸（水解）法：将淀粉乳先用-淀粉酶液化到一定程度，再用酸水解成葡萄糖。见P56不同糖化工艺所得糖液质量比较不同糖化工艺所得糖液质量比较项目酸解法酸酶法双酶法DE值(%)909598葡萄糖(%)869397灰分(%)1.60.40.1蛋白质(%)0.080.080.10羟甲基糠醛(%)0.300.080.03颜色(Be)10.00.30.2葡萄糖得率

16、(%)较酸法高5%较酸法高10%DE：也称葡萄糖值，是指糖化液中还原糖含量（以葡萄糖计）占干物质的百分率。不同糖化工艺比较不同糖化工艺比较项目项目酸解法酸解法酸酶法酸酶法双酶法双酶法淀粉糖转化率/%909598工艺条件/耗能加压温高/多加压温高/多温和/少副产物多中少生产周期短中长设备规模/防腐要求小/较高中/中大/一般原料适应情况淀粉大米各种淀粉、大米是否有利于发酵和提取差中有利见P58淀粉糖化工艺的比较淀粉糖化工艺的比较从淀粉水解操作周期看：双酶法酸酶法酸解法。从水解糖液的质量及降低糖耗、提高原料利用率方面来考虑：双酶法酸酶法酸解法。见P57二、水解糖液的质量要求二、水解糖液的质量要求项目

17、项目要求要求酸解法双酶法色泽淡黄色透明糊精反应无还原糖含量18%2538%DE值90%95%透光率40%60%pH4.64.8淀粉转化率92%95%见P72第三节第三节 培养基的设计和优化培养基的设计和优化在基本理论指导下，参照前人的经验配方，再结合菌种和产品的特性，初步确定可能的培养基组分；通过单因子试验确定最适的培养基组分；通过统计学方法确定各组分的最适浓度；试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基组分的选择培养基组分配比的确定不同规模培养基的优化培养基设计时的注意事项一、培养基组分的选择一、培养基组分的选择做好调查研究工作。选择一种较好的合成培养基做基础，通过摇瓶试验，摸索菌种对各种主要碳

18、源、氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。观察培养过程中pH的变化，确定菌种生长和产物合成的最适pH。确定各种无机元素的营养要求，即其最高、最低和最适用量。做复合培养基试验。做好调查研究工作。做好调查研究工作。了解菌种来源、生理生化特性和一般的营养要求；了解菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提纯方法和产品质量要求等。二、培养基组分配比的确定二、培养基组分配比的确定进行细胞生长和产物形成的化学平衡计算实验确定1、进行细胞生长和产物形成的、进行细胞生长和产物形成的化学平衡计算化学平衡计算初级代谢产物代谢途径比较清楚，可以根据物料平衡进行计算。次级代谢产物代谢途径了

19、解有限，因此要用化学计量关系计算得率比较困难。有些产物可以根据物料及能量平衡进行计算，但目前还难以作出精密分析。2、实验确定、实验确定培养基组分的配比最终都是通过实验确定。合理的实验设计方法单因子试验多因子试验（1）单因子试验）单因子试验对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。优点： 一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到结果。缺点：如果考察的条件多，实验时间会比较长。各因子之间可能会产生交互作用，影响结果的准确性。（2）多因子试验）多因子试验运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。 正交设计、均匀设计、响应面设计等； 利用统计学软件，如SAS、S

20、PSS、Matlab等。优点： 同时进行多个因子的试验。 用少量的实验得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。缺点： 一次分析的因素和水平不能太多； 必须有较为精确的参数作为参比标准。 正交设计正交设计是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。优点：可以通过较少的实验次数得到满意的结果。可通过方差分析，确定哪个因素影响较大。可以考察各因素间存在的交互作用。操作步骤操作步骤1. 确定因素数：选择处理因素与不可忽略的交互作用。2. 确定水平数二水平：有和无，可作因素筛选用。三水

21、平：可观察变化趋势，选择最佳搭配。多水平：一次满足试验要求。操作步骤操作步骤3. 选定正交表：Ln(tc)L：正交表代号；n：行数，表示需要做的试验次数；t：因素水平数，表示此表可以安排的水平数；c：列数，表示最多可以安排的因素个数。实验号实验号因素因素A因素因素B因素因素C因素因素D因素因素E1111112122223133334144445212346221437234128243219313421032431113312412342131341423144231415432411644132L16(45)操作步骤操作步骤4. 表头安排 应优先考虑交互作用不可忽略的处理因素，按照不可混杂的

22、原则，将它们及交互作用首先在表头排妥，而后再将剩余各因素任意安排在各列上。5. 组织实施方案 根据选定正交表中各因素占有列的水平数列，构成实施方案表，按实验号依次进行，共作n次实验，每次实验按表中横行的各水平组合进行。 均匀设计均匀设计只考虑试验点在试验范围内 “均匀分散”，而不考虑“整齐可比”。特别适合于多因素多水平的试验和系统模型完全未知的情况。优点：实验次数更少；自动将各试验因素分类为重要与次要，并将因素按重要性排序。 当试验中有m个因素，每个因素有n个水平时：全面试验：共有nm种组合；正交设计：挑选出n2个试验；均匀设计：选取n个点试验。操作步骤操作步骤选择试验因素。确定因素水平。选择

23、均匀设计表。明确试验方案，进行试验操作。试验结果分析：回归分析法、直接观察法。优化条件的试验验证。缩小试验范围进行更精确的试验，寻找更好的试验条件，直至达到试验目的为止。 响应面设计响应面设计是将体系的响应（试验指标）作为一个或多个因素的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件。操作步骤操作步骤通过大量的试验数据建立一个合适的数学模型。最常用的是多元线性回归法。用数学模型作图。 一个因素：响应面是二维空间中的一条曲线； 二个因素：响应面是三维空间中的曲面； 二因素以上：要在三维以上的抽象空间才能表示。一般先进行主成分分析进行降维后，再在三维或

24、二维空间中加以描述。类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与发酵工业，2004类胡萝卜素的用途：色素、营养保健类胡萝卜素的用途：色素、营养保健类胡萝卜素高产菌类胡萝卜素高产菌Y11的的培养基的优化培养基的优化类胡萝卜素的用途：色素、营养保健实验内容初步确定可能的培养基组分单因子试验确定最适的培养基组分正交实验确定最适培养基组分配比优化培养基的发酵结果郭秒,食品与工业发酵，2004初始培养基初始培养基1、初步确定可能的培养基组分、初步确定可能的培养基组分2、单因子试验确定最适的碳源、单因子试验确定最适的碳源考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源乙酸钠的浓度0.2%比较好确定最适的培养基组分确

25、定最适的培养基组分碳源：乙酸钠。氮源：氯化铵，酵母膏。3、正交实验确定最适培养基组分配比、正交实验确定最适培养基组分配比 由表看出，因素A和因素C对实验结果影响特别显著。对因素A，最大数是K1；对因素C，最大数是K3，因此选择A1C3。对于因素B和D选择最大数K2和K1。优化后培养基配方：优化前培养基配方：改进后培养基原培养基4 4、优化培养基的发酵结果、优化培养基的发酵结果三、不同规模培养基的优化三、不同规模培养基的优化摇瓶小型发酵罐中试发酵罐生产发酵罐pHpH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究青霉素发酵青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO

26、4 0.8%，轻质碳酸钙1%。发酵罐：葡萄糖流加控制总量1015%，玉米浆总量48% ，补加硫酸、前体等四、培养基设计时的注意事项四、培养基设计时的注意事项 注意各成分之间的配比合适。注意控制合适的pH。避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀。注意代谢调节物的影响。注意金属离子的影响。原料的预处理和质量灭菌如前体物质、诱导剂、阻遏物、抑制剂等。葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质，不能被微生物利用，因此二者需分开灭菌。硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此二者也不宜直接配成培养基。铁、锰和锌离子都能明显影响柠檬酸产量；钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用；钴离子对

27、葡萄糖异构酶的发酵是必需的。第四节第四节 发酵培养基灭菌发酵培养基灭菌常用灭菌方法培养基和设备的灭菌发酵培养基灭菌工艺一、常用灭菌方法一、常用灭菌方法干热灭菌湿热灭菌辐射灭菌化学药剂灭菌过滤除菌见P73二、培养基和设备的灭菌二、培养基和设备的灭菌培养基湿热灭菌原理灭菌温度与时间的选择影响培养基灭菌效果的因素（一）培养基湿热灭菌原理（一）培养基湿热灭菌原理微生物的热阻微生物的热死定律对数残留定律反应速率常数1、微生物的热阻、微生物的热阻致死温度：杀死微生物的极限温度称为致死温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。致死温度和致死时间是衡量热灭菌的指标。热阻：是指微生物

28、在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：是指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。见P77某些微生物的相对热阻某些微生物的相对热阻及其对一些灭菌剂的相对抵抗力及其对一些灭菌剂的相对抵抗力灭菌方式灭菌方式 大肠杆菌大肠杆菌 霉菌孢子霉菌孢子 细菌芽孢细菌芽孢病毒病毒干热121010001湿热1210310615苯酚112110930甲醛12102502紫外微生物的热死定律、微生物的热死定律对数残留定律对数残留定律kNdtdNttNNktNNkt00lg303.2ln1或teNNkt0灭菌过程中，微生物热死速率与任

29、一瞬间残存的活菌数成正比。l若Nt0，则t为。l工程上，灭菌设计时认为Nt0.001，即1000次灭菌中允许有1次失败。以微生物残留活菌数（Nt/N0）的对数与灭菌时间（t）作图，即得残留曲线，其斜率为-k（反应速率常数）。3、反应速率常数、反应速率常数反应速率常数k是微生物耐热性的一种特征，随微生物种类和灭菌温度而异。 相同温度下，k值愈小，微生物愈耐热。 同一种微生物，灭菌温度不同，k值不同，灭菌温度愈低（愈高），k值愈小（大）。121某些细菌芽孢的某些细菌芽孢的k值值细菌名称细菌名称k值值/min-1枯草芽孢杆菌FS52303.82.6硬质嗜热芽孢杆菌FS15180.77硬质嗜热芽孢杆菌

30、FS6172.9产气梭状芽孢杆菌PA36791.8（二）灭菌温度与时间的选择（二）灭菌温度与时间的选择温度（温度（）时间（时间（min）100120011015011551121151256.41302.4大多数细菌芽孢的杀灭温度和时间培养基灭菌过程中培养基灭菌过程中微生物死亡培养基成分破坏温度升高：死亡速率的增加培养基成分破坏速率的增加高温短时灭菌效果好（三）影响培养基灭菌效果的因素（三）影响培养基灭菌效果的因素灭菌温度和时间培养基成分脂肪、糖分、蛋白质含量高，微生物的耐热性增加；高浓度的盐类、色素等，削弱微生物的耐热性；高浓度的有机物，影响热的传入。培养基的物理状态固体培养基比液体培养基的

31、灭菌时间长；含有少量大颗粒及粗纤维的培养基，灭菌温度应适当提高。培养基的pH 培养基pH值愈低，灭菌所需时间愈短。 pH 6.08.0时，微生物最耐热。 pH6.0，微生物容易死亡。培养基中的微生物数量 培养基中微生物数量越多，灭菌所需时间越长。微生物细胞中水含量 微生物细胞含水越多，越容易死亡。微生物细胞的菌龄 年轻细胞比年老细胞容易死亡。微生物的耐热性 细菌营养体、酵母细胞、霉菌的菌丝体对热较敏感；放线菌、酵母、霉菌孢子抗热性稍好；细菌芽孢抗热性更强。空气排除情况 如果罐内空气排除不完全，罐内的实际温度就低于压力表显示压力所对应的温度。搅拌 必须保证培养基在罐内始终均匀地充分翻动，从而防止培养物质过多破坏或局部温度过低而杀菌不透。泡沫 泡沫影响热量传递，不易达到微生物的致死温度。培养基体积 体积越大，灭菌所需时间越长。三、发酵培养基灭菌工艺三、发酵培养基灭菌工艺间歇灭菌连续灭菌1、空罐灭菌、空罐灭菌空罐灭菌也称空消。当培养基（或物料）尚未进罐前对罐（包括种子罐、发酵罐、补料罐、消泡罐等）进行预先灭菌，是空罐灭菌。空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存