实验碘标记物纯化和鉴定

1、实验碘标记物纯化和鉴定 内容内容 一、抗体滴度的确定二、碘化标记物游离碘鉴定方法三、碘化标记物放化纯度一、抗体滴度的确定一、抗体滴度的确定通过本次实验了解设计试验方法的思路及全过程通过本次实验了解设计试验方法的思路及全过程1了解放射免疫分析系统中抗体滴度选择了解放射免疫分析系统中抗体滴度选择的方法，设计确定抗体滴度方法的实验的方法，设计确定抗体滴度方法的实验2掌握倍比稀释的操作步骤掌握倍比稀释的操作步骤3实验原理实验原理实验原理实验原理 浓缩抗血清用适当缓冲液稀后，与定量的标浓缩抗血清用适当缓冲液稀后，与定量的标记抗原反应至平衡，分离结合部分，记抗原反应至平衡，分离结合部分， 测不同稀释度抗体

2、与标记抗原结合率。测不同稀释度抗体与标记抗原结合率。 B/T=30-50%的抗体滴度为应用抗体滴度。的抗体滴度为应用抗体滴度。实验试剂实验试剂实验试剂实验试剂浓缩抗体125I-AbBSA缓冲液免疫分离剂T4AbT4Ag*实验步骤实验步骤 实验步骤实验步骤1从第2管起每管加100ul缓冲液21号管家100ul抗体，2号管加入100ul抗体混匀3从2号管中取出100ul加入3号管，混匀后再取出100ul加到4号管，依此类推。实验步骤实验步骤 实验步骤实验步骤4每管加入100ul的Ag*混匀5在离心之前，取一管测总T637度水浴1小时，向各管中加入1000ul分离剂，3000转/分钟，分离15-20

3、分钟 实验步骤实验步骤7测各管的cpm值实验结果实验结果 实验结果实验结果总T1:11:21:41:8cpm302541671814890115988208B/T(%)55.2649.2238.3427.131:161:321:641:128583840022436159819.3013.238.055.28 实验结果图实验结果图如图所示如图所示：B/T在在30%50%的相应抗体稀释度为的相应抗体稀释度为1：21：4 注意事项注意事项1、加量要准确。、加量要准确。2、用过的吸头不要互相污染、用过的吸头不要互相污染。3、离心时间要充足，离心前要加分离剂、离心时间要充足，离心前要加分离剂4、接触标

4、记物的器皿要单独处理，防止放射性污染。、接触标记物的器皿要单独处理，防止放射性污染。二、碘化标记物游离碘鉴定方法二、碘化标记物游离碘鉴定方法 实验目的实验目的根据评价标记抗原质量的标准设计鉴根据评价标记抗原质量的标准设计鉴定标记抗原方法的实验定标记抗原方法的实验1通过本次实验了解为实现某一目的而通过本次实验了解为实现某一目的而设计实验方法的思路及全过程设计实验方法的思路及全过程 实验原理实验原理 浓缩抗血清用适当缓冲液稀释后，与定量的标记抗原反应至平衡，分离结合部分，测不同稀释度抗体与标记抗原结合率。B/T=30-50%的抗体滴度为应用抗体滴度。实验试剂实验试剂 实验试剂实验试剂 实验步骤实验

5、步骤1取测量试管一只加入100ul125I标记物，加入缓冲液0.5ml，测量其总放射性。2向上述溶液加入10%三氯乙酸10ml，混合后，在300r/min条件下，离心10min.3从2号管中取出100ul加入3号管，混匀后再取出100ul加到4号管，依此类推。实验结果并计算实验结果并计算总放射性总放射性 总放射性 沉淀物浓度 cpm 14910 11832计算公式：游离碘=1-沉淀物放射性cpm总放射性cpm100% =1-1183214910100% 20%15%碘化标记物游离碘15%为合格此结果为不合格。实验结果分析实验结果分析 不合格的原因可能是由于 样品已过期; 时间过长出现放射杂质：

6、 脱落的放射性核素，因辐射损伤产生变性的标记抗原），游离碘的放射性升高。注意事项注意事项1、加量要准确。2、离心时间要足够。3、将废弃液的上清液倒入回收瓶中，不可随意丢弃。三、三、125I碘化标记物放化纯度碘化标记物放化纯度 实验原理实验原理用纸层析法分离碘化标记物的杂质，用纸层析法分离碘化标记物的杂质，从而可以计算碘化蛋白部分所占比例，从而可以计算碘化蛋白部分所占比例，即为该标记物的放化纯度。即为该标记物的放化纯度。 实验试剂实验试剂 实验步骤实验步骤 将滤纸条浸于将滤纸条浸于1%KI溶液中过夜，次日取出晾干。溶液中过夜，次日取出晾干。 从无孔端用铅笔以从无孔端用铅笔以1cm等距离画等距离画

7、1012条线。条线。 在第一线出点样在第一线出点样510ul125I标记物晾干。标记物晾干。 将此滤纸条放入层析槽中，使末端浸于展开剂中约将此滤纸条放入层析槽中，使末端浸于展开剂中约5mm 2小时候取出纸条晾干，然后沿线剪开，分别放入相应试小时候取出纸条晾干，然后沿线剪开，分别放入相应试管中编号标记。管中编号标记。每管内加入每管内加入0.5mlH2O,并记录数据及作图。并记录数据及作图。实验结果管号管号123456789101112总总ALBcpm3364921324860484890724272361476EPOcpm17462211723951485469305448514473下面将以管

8、号为横坐标，每管的cpm为纵坐标作图。ALBEPO实验计算及分析实验计算及分析如图所示：ALB的放化纯度=cpm1+cpm2+cpm3cpm总100% 65%EPO的放化纯度=cpm1+cpm2+cpm3cpm总100% 90%分析： ALB放化纯度90%可能原因为：层析时间不足，未充分分离样品过期，有杂值出现。 EPO放化纯度=90%，结果较理想。注意事项注意事项1、点样时要轻快，点样面积要尽量小点样时要轻快，点样面积要尽量小2、各层析纸应标明点样名称及有效期、各层析纸应标明点样名称及有效期3、层析时间要充分，需、层析时间要充分，需1.5小时或以上小时或以上4、展开时，标记物切勿侵入展开剂中

9、、展开时，标记物切勿侵入展开剂中凝胶过滤法凝胶过滤法l葡聚糖凝胶过滤法l琼脂糖凝胶过滤法l聚丙烯酰胺过滤法分类示意图 注意事项注意事项：l根据抗原分子量选择凝胶和层析柱根据抗原分子量选择凝胶和层析柱l层析柱要新鲜制备层析柱要新鲜制备l选择合适的洗脱液，洗脱速度不超过选择合适的洗脱液，洗脱速度不超过0.5ml/分分l多数标记抗原在分离纯化前先用蛋白（多数标记抗原在分离纯化前先用蛋白（BSA或或RSA）保护）保护l洗脱液用部分收集器收集，所用的试管应先用蛋白处理洗脱液用部分收集器收集，所用的试管应先用蛋白处理l有时须经两次纯化，得到高质量的碘化标记物有时须经两次纯化，得到高质量的碘化标记物125I

10、-标记物柱层析分离纯化示意图 .损伤和聚合标记物 .125I标记物标记物 .游离125I- 离子交换层析法离子交换层析法离子交换层析利用蛋白质带电部分离子交换层析利用蛋白质带电部分, ,与具有相反电荷的离子交换吸附与具有相反电荷的离子交换吸附以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 。在碘标记物的纯化中在碘标记物的纯化中以蛋白质为例，利用蛋白质带电部分，与具有相反电荷的离子交换吸附，进行分离。阴离子交换剂可与蛋白质的-COO 交换吸附。阳离子交换剂可与蛋白质-NH3+ 交换。本法多适用于纯化短肽类标记本法多适用于纯

11、化短肽类标记物。物。薄层层析法薄层层析法用硅胶G或氧化铝铺板，然后活化。将碘化反应液在薄板上点样，并用适当的展开剂展开。最后分段取下，分别用适当的缓冲液溶解，收集碘化蛋白峰即为纯化的碘标记物。本法多适用于半抗原碘标记物的纯化，本法多适用于半抗原碘标记物的纯化，如甾体碘标记物和地高辛碘标记物。电泳法电泳法根据化合物分子所带电荷及半径不同，其在电场中分子的迁移率也不同的原理，用电泳的方法可以进行纯化分离。这种方法主要用于对碘化物纯度的鉴定，这种方法主要用于对碘化物纯度的鉴定，很少用于碘标记物的制备。很少用于碘标记物的制备。高压液相法（高压液相法（HPLCHPLC）与凝胶过滤法的原理基本相同分离效率

12、高、速度快、适用范围广、可获得较纯的碘标记物但 需 要 一 定 的 设 备 条 件 ， 未 能 广 泛 应 用关键:选取合适的流动相与固定相放化纯度的鉴定放化纯度的鉴定1.层析法层析法:有薄层层析法和纸层析法，纸层析法最为常用有薄层层析法和纸层析法，纸层析法最为常用（1）将滤纸浸于）将滤纸浸于1%KI溶液中过夜备用溶液中过夜备用（2）使用前要将滤纸吹干）使用前要将滤纸吹干 ，并按每，并按每1cm距离用铅笔标出距离用铅笔标出（3）将待鉴定的标记物）将待鉴定的标记物5l-10l点样于距端点点样于距端点1cm处，晾干处，晾干（4）将已点样的滤纸条放入层析缸内，然后加展开剂）将已点样的滤纸条放入层析缸

13、内，然后加展开剂 正丁醇正丁醇:乙醇乙醇:氨水氨水:水水=20:1:0.5:1（5）展开后将滤纸取出并吹干，然后按每）展开后将滤纸取出并吹干，然后按每1cm距离剪开，并分段进行距离剪开，并分段进行计数。计数。 以每段的以每段的cpm为纵坐标，分段纸条的序号为横坐标作图。近原点为纵坐标，分段纸条的序号为横坐标作图。近原点的第一峰为的第一峰为 标记蛋白峰。标记蛋白峰。 （6）计算放化纯度）计算放化纯度放化纯度（放化纯度（%）=蛋白峰放射强度蛋白峰放射强度/总放射强度总放射强度100%2.电泳法：常用的是纸电泳法操作与纸层析法相同，点样后进行电泳而不是层析。3.游离碘的测定：蛋白类碘化标记物可用三氯乙酸沉淀法。取1000020000cpm的标记物，并计数。然后加20%三氯乙酸1ml及2%BSA溶液0.5ml，混匀后3000rpm离心10分钟，弃上清并计数沉淀的放射活性。游离碘率（%）=1-沉淀cpm数/总cpm数100%纯化过的碘标记物的游离碘率不应该超过5%10%4.抗体结合鉴定法：将标记抗原与过量的抗体反应，其NSB/T应5%，B0/T应80%。非特异性结合（NSB）增加，而最大结合力（B0/T）下降，则说明标记物的纯度差。免疫活性的测定免疫活性的测定1.过量抗体法 Ag* + Ab（过量） NSB/T80% 如果NSB增加，最大结合力降低，表