实验四 核酸的鉴定

1、DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳实实 验验 二二学时：学时：3 31 1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。原理和方法。2 2、学习核酸染色的方法。、学习核酸染色的方法。 一、实验目的一、实验目的： （一）电泳技术：（一）电泳技术： 1 1、电泳定义：电泳定义：是指带电粒子在电场中向与其自身是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。所带电荷相反的电极方向移动的现象。 根据电泳支持介质的不同，可分为滤纸，醋酸纤维薄膜，根据电泳支持介质的不同，可分为滤纸，醋酸纤维薄膜，淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。电泳技术的应用淀粉、琼脂糖、

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。电泳技术的应用非常广泛，从分离小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到非常广泛，从分离小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定都复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定都依赖于电泳技术。依赖于电泳技术。二、实验原理二、实验原理: （1 1）带电颗粒的大小和形状：）带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；越慢，反之越快；（2 2）颗粒的电荷数：）颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；之越快；（3 3） 溶液的粘度：溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之粘度越大

3、，电泳速度越慢，反之越快；越快；（4 4）溶液的）溶液的pHpH值：值：影响被分离物质的解离度，离等影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；电点越近，电泳速度越慢，反之越快； 2 2、影响电泳的主要因素：影响电泳的主要因素： （5 5）电场强度：）电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；之越快；（6 6）离子强度：）离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；之越快；（7 7）电渗现象：）电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；相对移动；（8 8）支持物筛孔大小

4、：）支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之孔径小，电泳速度慢，反之则快。则快。l琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳是用电泳是用琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。l琼脂糖琼脂糖英文名英文名agarose，是从，是从琼脂琼脂中提取出来的，由中提取出来的，由半半乳糖乳糖和和3.6-3.6-脱水脱水- - 半乳糖半乳糖相互结合的相互结合的链状多糖链状多糖。琼脂糖和琼脂糖和琼脂琼脂都可在不同浓

5、度的水溶液下可形成都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶多孔的凝胶，电泳，电泳中具有中具有分子筛效应分子筛效应。（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：lDNADNA分子分子在在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（中向正极移动（电荷效应电荷效应） 。lDNA分子泳动速率的大小除与分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关分子的带电量有关外，还与外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的的分子筛效应分子筛效应）。）。l电泳时，用电泳时，用溴酚蓝溴酚蓝做前沿指示剂

6、，指示做前沿指示剂，指示DNA样品在凝样品在凝胶中的确切位置。胶中的确切位置。l溴乙啶溴乙啶是一种荧光染料，可插入是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两双螺旋结构的两个碱基对之间，与个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。这次实验使用发下发出橙黄色的荧光。这次实验使用溴乙啶替代品溴乙啶替代品（DNAgreen）DNAgreen核酸染料vDNAgreen是一种花箐类染料，具有安全、灵敏作为各种核酸电泳的染色剂。vDNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254-380nm还有一个吸收峰，与核酸结合后发射绿色荧光，因此在紫外凝

7、胶透射仪上可以检测出DNA样品。v作为EB的一种替代品。（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，凝胶中，DNA片段迁移率与片段迁移率与DNA分子大小成反比分子大小成反比( 20kb) ，因此通，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。测出未知片段的大小。（2）核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型不同构型DNA的移动速度次序为：闭环的移动速度次序为：闭环DNA直线直线DNA开环的双链开环的双链环状环状D

8、NA(当琼脂糖浓度太高时，环状当琼脂糖浓度太高时，环状DNA不能进入胶中不能进入胶中)。（3）不同大小的不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。分离。琼脂糖浓度琼脂糖浓度/%/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状线状DNADNA大小大小/kb/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注：注：DNADNA片段在片段在5-500bp5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）进行电泳分离。）进行电泳分离。（三）琼脂糖凝胶电泳

9、分离核酸的影响因素（三）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素（1 1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离快、分离DNADNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。（2 2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。高，重复性好。（3 3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。光检测及定量测定。（4 4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱

10、，便于定量测定。制）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。成干膜可长期保存。因此，因此，琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一，究中常用实验方法之一， DNADNA样本的分离、纯化、鉴定以及样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。（四）（四）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：电泳具有以下优点：DNA Marker 荧光染料荧光染料EB染色染色后，在紫外灯后，在紫外灯(305nm)下观察下观察到的电泳结果：到的电泳结果：1 1、实验材料：、实

11、验材料：提取的小麦苗中的提取的小麦苗中的DNADNA2 2、仪器：、仪器： (1)(1)稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 (2)(2)可调微量移液器可调微量移液器 (3)(3)水平电泳槽水平电泳槽 （4 4）暗箱紫外透射仪等。）暗箱紫外透射仪等。3 3、试剂：、试剂：（1 1）电泳缓冲液：）电泳缓冲液：TrisTris- -硼酸EDTAEDTA（5050TBETBE）pH8.3pH8.3。（2 2）加样缓冲液：）加样缓冲液：0.25%0.25%溴酚蓝（溴酚蓝（BPBBPB），），40%40%蔗糖，蔗糖，DNAgreenDNAgreen。 (4)(4)琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：浓度为浓度为0.7%0.

12、7%。 三、实验材料、仪器和试剂三、实验材料、仪器和试剂：1 1、凝胶板的制备：、凝胶板的制备：（1 1）取琼脂糖）取琼脂糖0.7 g0.7 g，加，加1 1TBETBE缓冲溶液缓冲溶液100ml100ml，于沸水浴中至熔化，制，于沸水浴中至熔化，制成成0.7%0.7%的琼脂糖胶液。的琼脂糖胶液。（2 2）胶床两头贴上防水胶带，形成）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。上。（3 3）插入梳子，梳齿下端离板底插入梳子，梳齿下端离板底0.50.51mm1mm。（4 4）当琼脂糖胶液温度降到）当琼脂糖胶液温度降到6060的时候的时候,

13、 ,将将6060凝胶不间断倒入胶床，高凝胶不间断倒入胶床，高3 34mm4mm，避免产生气泡，室温下凝固。，避免产生气泡，室温下凝固。（5 5）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面面1 12mm2mm，从一头轻轻斜拉，从一头轻轻斜拉 梳子，除去产生的气泡。梳子，除去产生的气泡。四、实验步骤：四、实验步骤： 3 3、加样：、加样： 将样品将样品DNADNA溶液与加样缓冲液以溶液与加样缓冲液以5 5 ：1 1的体积比混合，用的体积比混合，用微量进样器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量微量进样器加样，每加完一个样品

14、，冲洗三次。加样量151520 20 l l （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝（加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部）。胶底部）。4 4、电泳：、电泳： 为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNADNA片段的最大分辨率，电场强度不片段的最大分辨率，电场强度不应高于应高于5V/cm5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)(80V)，样品一进入胶内则将电压调至样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 5V/cm 。当染料前沿移至底边。当染料前沿移至底边1-2mm1-2mm时，电泳毕。时，电泳毕。5 5、染色、观察、显微照相与记录、

15、染色、观察、显微照相与记录： 关闭电源，取出胶床，浸入关闭电源，取出胶床，浸入0.5g/mL0.5g/mL的的EBEB溶液中，溶液中，30min30min后取出。在紫外检测仪下观察凝胶中的后取出。在紫外检测仪下观察凝胶中的DNADNA（红橙色荧（红橙色荧光），并进行显微照相。最后要求绘制光），并进行显微照相。最后要求绘制DNADNA电泳图谱。电泳图谱。五、思考题：五、思考题：影响电泳的主要因素影响电泳的主要因素? ? * * 荧光染料荧光染料EBEB染色的原理和优点是什么？染色的原理和优点是什么？ 1 1、原理：、原理： EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-

16、苯基菲锭溴盐苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)(Ethidium Bromide)。 EBEB是一种扁平分子，它可以嵌是一种扁平分子，它可以嵌入核酸相邻的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙入核酸相邻的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。它与色荧光。它与DNADNA的结合几乎没有碱基序列特异性。的结合几乎没有碱基序列特异性。 溴化乙锭嵌入碱基分子中，导致溴化乙锭嵌入碱基分子中，导致DNA在复制过程中错配在复制过程中错配 。所以所以溴化乙锭是一种强诱变剂，溴化乙锭是一种强诱变剂，具有高致癌性具有高致癌性。在实验过程。在实验过程一定要带上手套！一定要带上手套！ 2 2、优点：、优

17、点：（1 1）染色比较简便、快捷，一般在）染色比较简便、快捷，一般在101015min15min就可反应。就可反应。（2 2）EBEB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB灵敏度高，可检测出灵敏度高，可检测出10ng10ng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的检测。的检测。（5 5）EBEB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。灯检测电泳的进程和效果。（6 6）EB-DNAEB-DNA复合物中的复合物中的EBEB发出的荧光比游离的发出的荧光比游离的EBEB强强1010倍，倍， 因此不需洗净凝胶中游离的因此不需洗净凝胶中游离的EBEB也可检测出也可检测出DNADNA的条带。的条带。3 3、缺点：、缺点： 溴乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时溴乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道