实验二 PCR引物设计

1、实验内容 PCR 引物设计要点引物设计要点 Primer Premier 软件设计引物软件设计引物ncbi 在线在线 primer-Blast 获取候选引物获取候选引物引物对的特异性验证引物对的特异性验证PCRPCR反应一般由三个步骤组成反应一般由三个步骤组成： 模板的热变性模板的热变性； 引物复性到单链模板上引物复性到单链模板上； 热稳定热稳定DNADNA聚合酶催化的聚合酶催化的延伸延伸一、引物设计要点一、引物设计要点 GC含量应在含量应在40%-60%（ 45%-55% ）之间；）之间； 4种碱基在引物中分配均匀；种碱基在引物中分配均匀； 没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如没有多聚嘌呤或多聚嘧

2、啶序列，如AAAAA等；等； 没有二核苷酸重复序列，如没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；等；引物中与模板互补的区应为引物中与模板互补的区应为个核苷酸长个核苷酸长度；度；上下引物长度差别不能大于上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物，如上游引物为为19bp，下游引物为，下游引物为24bp等。等。 引物的引物的 Tm 值一般为值一般为50-70； 计算出来的两个引物的计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于值相差不能大于5 ； 扩增产物的扩增产物的 Tm 值与引物的值与引物的 Tm 值相差不能大于值相差不能大于10 ； 这些特性保证了扩增产物在每一个这些特性保证了扩增产物在每一个 PC

3、R 循环可循环可有效变性。有效变性。 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。 一个引物的一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形中引物浓度较高，会形成引物二聚体。成引物二聚体。 3末端的性质非常关键。末端的性质非常关键。 不推荐不推荐3末端有末端有.NNNCG或或.NNNGC序列的序列的引物，引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生；高自由能促进发夹及引物二聚体产生； 5端序列添加限制性酶切位点。端序列添加限制性酶切位点。二、二、Primer Premi

4、er 软件设计引物软件设计引物 是由加拿大的是由加拿大的 Premier Premier 公司开发的专业用于公司开发的专业用于PCRPCR或测序引物以及杂交探针或测序引物以及杂交探针的设计、评估的的设计、评估的软件软件 主要界面分为序列主要界面分为序列编辑窗口编辑窗口（genetankgenetank）、）、primer designprimer design、酶切分析酶切分析（restriction restriction sitesite）和）和 MotifMotif正向（正向（As isAs is）、反向（）、反向（reversedreversed）、互补（）、互补（complement

5、edcomplemented）及）及反向互补（反向互补（reverse complemented reverse complemented ）。）。Primer点击点击 SearchSearch，进行引物搜索，进行引物搜索Search criteria Search criteria 窗口：多种参数可以调整。窗口：多种参数可以调整。Primer LengthPrimer Length常设置在常设置在181830bp,30bp,短了特异性不好，长了没有必要。短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。切位点什么的。PCR Product

6、 sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之间，小于之间，小于100bp100bp的的PCRPCR产产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。求苛刻。ManualManualSearch parameters Search parameters 人工搜索参数设置窗口。人工搜索参数设置窗口。Search stringencySearch stringency应选应选HighHigh。GCGC含量一般是含量一般是40406060。其它参数默认就可以。其它参数默认就可以

7、。Search progress Search progress 窗口中显示窗口中显示Search CompletedOKSearch CompletedOK键键结果窗口结果窗口有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为引物按优劣次序排列，满分为100100。选其中的一对引物，在主。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。窗口显示结果。对于上述引物，如果其它各项指对于上述引物，如果其它各项指标还可以，可在引物末端去掉一标还可以，可在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有

8、变好点。看引物的评估参数有没有变好点。当然，搜索出的引物，其扩增产当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它。物很短，你可以不选择它。引物引物3 3端端22个个A A或或T,T,或引物内部或引物内部连续的连续的G G或或C C太多，或引物太多，或引物3 3端端22个个G G或或C C，这样的引物应作，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。为次选，没得选了就选它。该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”“S”和和“A”“A”可查看有义链可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模或反义链的引物。右边是

9、两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该注意：尾末给出该引物的最佳退火温度引物的最佳退火温度！第四层：四种重要指标的分析！第四层：四种重要指标的分析Ta：复性温度（：复性温度（退火温度退火温度），至关重要！），至关重要！退火温度太高，退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；扩增效率会非常低；退火温度太低，退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性而导致非特异性DNA片段的扩增；片段的扩增；退火温

10、度，通常比理论设计的引物和模板的退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值值低低 3-5 下进行。下进行。最好通过对最好通过对复性温度复性温度比两条比两条引物的引物的Tm 值低值低 2-10 内进行内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优预实验（梯度）来对复性条件的优化化。引物长度：引物长度：控制着引物的特异性和在控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火反应中的退火温度。长的温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构

11、。适宜引物成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为长度为18-27 nt。Tm 融链温度融链温度：根据相：根据相邻二碱基对作用原理来邻二碱基对作用原理来计算融链温度。计算融链温度。PCR 反应的合适反应的合适 Tm 范范围为围为56-63 （50-70）GC% 含量含量：对于：对于PCR 反应来说反应来说 GC含量在含量在50% 左右比左右比较合适。较合适。（40-60%,45-55%）Degeneracy多义性多义性，尽量减少，尽量减少引物多义性，这样会带来更好引物多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免的特异性，尽量避免3末端末端的多义性，因为这个位置即使的多义性，因为这个位

12、置即使一个碱基的错配都能阻止引物一个碱基的错配都能阻止引物延伸。延伸。 三、三、ncbi 在线在线 primer-Blast 获取候选引物获取候选引物点击点击Primer Blast/tools/primer-blast/或者打开或者打开mRNA序列序列后，点击后，点击Pick Primer 或者或者mBad基因编码序列基因编码序列至于至于RT-PCR所用的引物，最好是所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜使得产物跨过内含子，这样避免潜在在DNA对对RT-PCR的干扰。的干扰。 选择物种选择物种筛选时，上、下游引物不在同筛选时，上、

13、下游引物不在同一个外显子上的引物对。一个外显子上的引物对。 四、引物对的特异性验证：四、引物对的特异性验证：BLAST 验证验证引物引物如果一对PCR引物能够和其他基因或目的基因的其他位置配对，可能产生非特异性的扩增产物，甚至导致目的基因的扩增失败。通过NCBI上提供的，可检索到该物种中所有能够与所设计引物互补的序列，包括基因片段和基因组片段。http: //BLAST/点击点击Basic BLAST中的中的 nucleotide blast 选项选项 在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence栏中输入引物序列：

14、栏中输入引物序列： 例：例：mouse Badmouse Bad基因上游引物基因上游引物为为5 5- -GGGCAGCCACCAACAGTCATCAT-3GGGCAGCCACCAACAGTCATCAT-3 为本次搜索命名为本次搜索命名选该物种基因组和转录物选该物种基因组和转录物作为搜索的范围作为搜索的范围引物长度为引物长度为23nt23nt，每条，每条横线表明该匹配序列横线表明该匹配序列在引物上的位置。在引物上的位置。与引物匹配的序列有两类：转录物和基因组序列。在与引物匹配的序列有两类：转录物和基因组序列。在通过通过RT-PCRRT-PCR时由于提取时由于提取RNARNA的时候基因组的时候基因

15、组DNADNA可以被完可以被完全去除，基因组全去除，基因组DNADNA上潜在的引物匹配序列不会对扩上潜在的引物匹配序列不会对扩增目的基因造成影响，因此只有位于转录物上的匹配增目的基因造成影响，因此只有位于转录物上的匹配序列才有可能对序列才有可能对PCRPCR产物产生不利影响。产物产生不利影响。 目的基因目的基因 基因基因Tm9sf1Tm9sf1上有上有16nt16nt与引物与引物匹配，但是引物的匹配，但是引物的3 3端有端有3 3个碱基不能匹配的，因此不个碱基不能匹配的，因此不会对目的基因扩增产生影响。会对目的基因扩增产生影响。如果其他基因序列与上游引物的如果其他基因序列与上游引物的3 3端端

16、有匹配，有匹配，此时查看与下游引物的此时查看与下游引物的3 3端的匹配情况，如果不匹配的话，端的匹配情况，如果不匹配的话，不影响目的基因扩增结果。不影响目的基因扩增结果。分析结果表明，这对引物虽在分析结果表明，这对引物虽在其他基因序列上有不同程度其他基因序列上有不同程度的错配，但是他们对的错配，但是他们对mBad mBad 基基因扩增不会产生不利影响，因扩增不会产生不利影响，属于特异性较好的引物对。属于特异性较好的引物对。 在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence栏中输入引物序列：栏中输入引物序列： 例：例：引物为引物为5 5-CTGAGATCCTG

17、AGCCTTTGG-3-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3; ; 5 5-TGCCCATCACAACATCATCT-3-TGCCCATCACAACATCATCT-3 同时输入上下游引物。输入上下游引物都从同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5 5 3 3。输入上游引物后，加上输入上游引物后，加上2020个字母个字母n n，再输入下游引物。，再输入下游引物。 在在Choose Search SetChoose Search Set栏中：栏中：DatabaseDatabase根据预操作基根据预操作基因的种属定了，可选因的种属定了，可选Human genomic + transcript

18、Human genomic + transcript或或OthersOthers 在在Program SelectionProgram Selection中：选择中：选择Somewhat similar Somewhat similar sequences (blastn)sequences (blastn)项，如下图：项，如下图： 在此界面最下面关键要点击在此界面最下面关键要点击Algorithm parametersAlgorithm parameters参参数设置，进入参数设置界面。数设置，进入参数设置界面。 在在General ParametersGeneral Parameters中：中：Expect thressholdExpect thresshold期望阈值须改为期望阈值须改为10001000，大于，大于10001000也可以；在也可以；在Word sizeWord size的下拉框将数字改为的下拉框将数字改为7 7。 图中图中：序列与引物匹配的得分值小于：序列与引物匹配的得分值小于4040分、分、40405050分、分、50-8050-80分、分、80-20080-200分等分等，分值越高，特异性越好；，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游线段代表上或