实验三 病原细菌的鉴定与药物敏感性(大)

1、1实验三实验三 病原细菌的分离、鉴定与毒力分析病原细菌的分离、鉴定与毒力分析一、实验目的一、实验目的1 1掌握无菌操作条件下致病菌的分离方法与程序；掌握无菌操作条件下致病菌的分离方法与程序；2 2了解细菌鉴定的方法，熟悉细菌常用的生理生了解细菌鉴定的方法，熟悉细菌常用的生理生化反应及原理。化反应及原理。2二、实验内容二、实验内容1. 1. 平板划线法分离病原细菌；平板划线法分离病原细菌；2 2病原细菌的形态与生理生化鉴定；病原细菌的形态与生理生化鉴定；3 3病原细菌的人工感染（课外选作实验）。病原细菌的人工感染（课外选作实验）。3三、主要仪器及试材三、主要仪器及试材 显微镜，解剖镜，解剖用具，

2、包括解剖盘、解显微镜，解剖镜，解剖用具，包括解剖盘、解剖刀、解剖针、大小手术剪、大小镊子，培养剖刀、解剖针、大小手术剪、大小镊子，培养皿、载玻片、盖玻片、纱布等。皿、载玻片、盖玻片、纱布等。 蒸馏水、鱼用生理盐水，蒸馏水、鱼用生理盐水，70%70%的乙醇、的乙醇、BHIBHI培养培养基、生化管等。基、生化管等。 人工感染嗜水气单胞菌的鱼，未知病原菌感染人工感染嗜水气单胞菌的鱼，未知病原菌感染的鱼的鱼（剪掉部分背鳍或腹鳍作为标记（剪掉部分背鳍或腹鳍作为标记) )。4四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤（一）（一） 病原细菌的分离病原细菌的分离1 1无菌操作打开病鱼的腹腔：无菌操作打开病鱼的腹腔：

3、2 2细菌划线接种：细菌划线接种：3 3培养与观察：培养与观察：（二）病原细菌的革兰氏染（二）病原细菌的革兰氏染色色分别取嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌分别取嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和个人分离的未知菌株进行革兰氏染色，记录结果。和个人分离的未知菌株进行革兰氏染色，记录结果。5四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤（三）病原细菌的生理生化鉴定（三）病原细菌的生理生化鉴定分别测定分别测定分离菌分离菌和和嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌的的1212种生化指标：种生化指标：氧化酶，吲哚实验，氧化酶，吲哚实验，VPVP，H H2 2S S，鸟氨酸脱羧酶，精氨，鸟氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶性，七叶

4、苷，赖氨酸脱羧酶，山梨醇，蔗酸双水解酶性，七叶苷，赖氨酸脱羧酶，山梨醇，蔗糖，纤维二糖，明胶。糖，纤维二糖，明胶。取生化管于距离内容物上方取生化管于距离内容物上方2cm2cm处用砂轮割开，处用砂轮割开，迅速于酒精灯火焰消毒，然后接种菌株，以迅速于酒精灯火焰消毒，然后接种菌株，以封口膜封口膜或或液体石蜡封口，置液体石蜡封口，置3535孵孵育，育，依据说明书进行。依据说明书进行。6四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤（四）病原细菌的毒力分析（四）病原细菌的毒力分析1 1实验鱼：实验鱼：实验环境下暂养实验环境下暂养7-107-10天。每组不少于天。每组不少于5050条条，设不，设不少于少于3 3个平

5、行重复。个平行重复。2 2菌悬液制备：菌悬液制备：液体培养基增殖，用无菌生理盐水悬浮。经液体培养基增殖，用无菌生理盐水悬浮。经计数后采用等对数间距设计约计数后采用等对数间距设计约5 5个感染剂量个感染剂量进行感染试验。对进行感染试验。对照组以无菌生理盐水。照组以无菌生理盐水。3 3注射方法：注射方法：感染前实验鱼用感染前实验鱼用MS-222MS-222麻醉，用湿毛巾裹住鱼麻醉，用湿毛巾裹住鱼体头部。体头部。（1 1）腹腔注射：腹鳍基部无鳞片处。）腹腔注射：腹鳍基部无鳞片处。（2 2）肌肉注射：背鳍前端与侧线之间的中部区域。）肌肉注射：背鳍前端与侧线之间的中部区域。7四、实验方法与步骤四、实验方

6、法与步骤（四）药物敏感性实验（四）药物敏感性实验（一）纸片扩散法（一）纸片扩散法 1.1.原理：原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度递减的浓度梯度，细菌的，细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，即抑菌圈愈大，药物敏感性越强。对测定药物的敏感程度，即抑菌圈愈大，药物敏感性越强。8

7、四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤2.2.实验操作实验操作 1 1）倒平板）倒平板 2 2）菌悬液制备：）菌悬液制备：挑取斜面中菌苔于少量生理盐水中制成细挑取斜面中菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将菌液浓度调到菌悬液，将菌液浓度调到1 1* *10107 7 cfu/mL cfu/mL。以玻璃刮铲将。以玻璃刮铲将0.1mL0.1mL细菌悬液均匀涂布于平皿培养基表面；细菌悬液均匀涂布于平皿培养基表面； 3 3）贴片：）贴片：将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊平皿培养基表面。为了使药敏片与培养

8、基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了能准确观察结果，要求药敏片能有子轻按几下药敏片。为了能准确观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上（在平皿中均匀贴四片）；规律的分布于平皿培养基上（在平皿中均匀贴四片）； 4 4）培养：）培养：2828温箱中培养温箱中培养24 h24 h，记录结果；，记录结果；9四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤结果观察：抑菌圈直径大小与药物浓度、细菌浓度有直接关结果观察：抑菌圈直径大小与药物浓度、细菌浓度有直接关系，观察抑菌圈的有无。若有抑菌圈，则测量抑菌圈直径；系，观察抑菌圈的有无。若有抑菌圈，则测量抑菌圈直径；若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。若无

9、抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。 抑菌圈直径抑菌圈直径15mm 15mm 高度敏感高度敏感 抑菌圈直径抑菌圈直径10-15mm 10-15mm 中度敏感中度敏感 抑菌圈直径抑菌圈直径10mm 10mm 低度敏感低度敏感 无抑菌圈无抑菌圈 不敏感或耐药不敏感或耐药氟：氟：7575g/g/mLmL；恩：；恩：5 5 g/g/mLmL 磺：磺：300300g/g/mLmL；青：；青：10IU/mL10IU/mL10磺磺氟氟靑靑嗯嗯12四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤（二）肉汤试管稀释法（二）肉汤试管稀释法 1.1.原理：原理：以肉汤液体培养基将抗生素作不同浓度的稀以肉汤液体培养基将抗生素作不

10、同浓度的稀释，然后接入待检菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低释，然后接入待检菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（抑菌浓度（MICMIC）。）。 2.2.实验操作实验操作 1 1）菌液准备：）菌液准备：挑取金黄色葡萄球菌斜面中的菌苔于少挑取金黄色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将菌液浓度调到量生理盐水中制成细菌悬液，将菌液浓度调到1 1* *10107 7cfu/mLcfu/mL备用；备用；13四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤2 2）抗菌药物稀释（硫酸庆大霉素注射液）：）抗菌药物稀释（硫酸庆大霉素注射液）：配制药物原液配制药物原液浓度为浓度为8 8万万IU/mLIU

11、/mL（80mg/mL80mg/mL），），0.45 0.45 m m滤器除菌。滤器除菌。 准备准备1111支支2 mL2 mL无菌无菌EPEP管编号管编号010010排好，在排好，在0 0号管和号管和1 1号管中加号管中加1.8 1.8 mLmL无菌生理盐水，无菌生理盐水，210210号管加号管加1 mL1 mL； 吸取吸取0.2 mL0.2 mL药原液加入第一支药原液加入第一支EPEP管中混匀，从第一支试管中吸取管中混匀，从第一支试管中吸取0.2 mL0.2 mL加入第二支加入第二支EPEP管混匀，然后吸取管混匀，然后吸取1 mL1 mL加入第三支混匀加入第三支混匀以此类以此类推，直到第十

12、一支；推，直到第十一支； 取取1212支灭过菌的玻璃试管编号支灭过菌的玻璃试管编号1-121-12排好，各加入排好，各加入1.8mL1.8mL灭过菌的灭过菌的培养液，然后从编号相对应的培养液，然后从编号相对应的EPEP管中吸取稀释过的药液再做管中吸取稀释过的药液再做1010倍比稀倍比稀释。释。14四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤3 3）接种：）接种：每只试管中加入每只试管中加入0.1ml0.1ml的菌液；的菌液； 4 4）培养：）培养：置置3737温箱，培养温箱，培养24h24h；5 5）结果观察：）结果观察：肉眼观察，以不出现肉眼可见生长的最低药肉眼观察，以不出现肉眼可见生长的最低药物浓

13、度为该药对测试菌的物浓度为该药对测试菌的MICMIC。根据结果换算出最小抑菌浓度（根据结果换算出最小抑菌浓度（g/mLg/mL）。）。8000 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78无菌生理盐水无菌生理盐水1.8mL0.2mL抗生素抗生素8万万/mL 下排培养液每管下排培养液每管1.8mL对应加对应加0.2mL 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.6 0.3 0.15 00.816五、实验注意事项五、实验注意事项 分离、接种时严格按照无菌操作要求进行。分离、接种时严格按照无菌操作要求进行。 革兰氏染色过程中涂片务求均匀，切忌过

14、厚，染色过革兰氏染色过程中涂片务求均匀，切忌过厚，染色过程中不可使染液干涸。程中不可使染液干涸。 药敏实验，在贴片时用无菌镊子轻轻触压药物纸片，药敏实验，在贴片时用无菌镊子轻轻触压药物纸片，使之与培养基充分接触，贴片后不能再更改纸片位置；使之与培养基充分接触，贴片后不能再更改纸片位置；镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响。置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响。17六、实验安排六、实验安排1-41-4节节(1)(1)配培养基（固体、液体分装），包培养皿（配培养基（固体、液体分装），包培

15、养皿（1010包），包），配制生理盐水，灭菌（配制生理盐水，灭菌（4 4瓶）；瓶）；(2)(2)完成细菌染色、观察和生化指标测定；完成细菌染色、观察和生化指标测定；4-84-8节节(1)(1)倒平板接种贴纸；倒平板接种贴纸；(2)(2)药液稀释接种；（药液稀释接种；（3 3）第二天早）第二天早上看结果。上看结果。18七、实验报告（一）七、实验报告（一）1 1记录菌落特征、细菌形态、染色结果和生理生化结果（记录菌落特征、细菌形态、染色结果和生理生化结果（3030分）。分）。2 2，据细菌形态特征和生化指标初步鉴定分离自患病鱼的细菌，据细菌形态特征和生化指标初步鉴定分离自患病鱼的细菌种类（种类（2020