基因工程基本原理第三章基因克隆载体

1、基因工程基本原理第三章基因克隆载体DNA重组（限制性内切酶）运输工具运输工具基因克隆载体基因克隆载体 目的基因的制备目的基因导入受体细胞 外源基因的表达基因工程的应用第三章第三章 基因克隆载体基因克隆载体克隆载体克隆载体：一种具有特定功能的DNA分子，他们将携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并使其在特定受体细胞中得以维持或表达。原核生物克隆载体真核生物克隆载体穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体。针对受体细胞的可转移性自主复制功能：ori显著的筛选标记：抗药性或显色特定的多克隆位点：RE位点安全性：不含

2、对受体有害基因、不任意转入其它细胞尤其是人体细胞第一节第一节 克隆载体的一般特征克隆载体的一般特征一、细菌质粒载体一、细菌质粒载体第二节第二节 原核生物基因克隆载体原核生物基因克隆载体细菌质粒载体是以细菌质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，主要用于外源基因片段的转移、贮存、表达以及基因文库的构建等。宿主细胞染色体外裸露的双链DNA分子。（一）质粒（一）质粒（Plasmid）组成与构型）组成与构型1.质粒构型：质粒构型：共价闭合环型DNA（ccc-DNA）呈超螺旋SC构型开环DNA（oc-DNA）线性DNA（L-DNA）ccc-DNAl-DNAoc-DNA2. 质粒质粒DNA分子大小分子大小3.

3、 质粒的复制质粒的复制严紧型质粒：1个寄主内仅含1-3拷贝松弛型质粒：1个寄主内含10-60拷贝 质粒质粒DNA复制复制：单向复制，受宿主细胞和质粒遗传系统双重控制，不会无限制复制。质粒质粒DNA复制控制机理的分子模型复制控制机理的分子模型： 自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model）抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model） 质粒控制质粒控制：Ori序列拷贝数：细胞内某种质粒的数量与染色体的数量之比。自体阻遏蛋白质模型：自体阻遏蛋白质模型：质粒DNA复制控制机理有两种解释解释一：解释一： 质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质Rep引发的。Rep

4、蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过同启动子-操纵基因区（P/O）的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Atr和Rep蛋白质处于恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合，来引发质粒DNA的复制图（a）。自体阻遏蛋白质自体阻遏蛋白质模型：模型：解释二解释二： Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒DNA进行复制图（b） 抑

5、制蛋白质稀抑制蛋白质稀释模型：释模型：质粒DNA的复制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质Cop调控的。细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比。Cop抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径：通过同质粒DNA的复制起点（ori）结合，直接地抑制质粒DNA的复制。通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象叫质粒不亲和性。随着细胞分裂质粒分配到子细胞随着细胞分裂质粒分配到子细胞质粒拷贝数加倍质粒拷贝数加倍两种不相容质粒的拷贝数变化两种不相容质粒的拷贝数变化4. 质粒的不亲和

6、性质粒的不亲和性野生型与其衍生物通常属于不亲和质粒，因此，受体细胞最好不含内源野生型与其衍生物通常属于不亲和质粒，因此，受体细胞最好不含内源质粒质粒接合型质粒：含有tra基因的质粒。F质粒非接合型质粒：不含tra基因的质粒。ColE15. 质粒迁移质粒迁移转移性质粒可在细胞间转移，并能带动染色体发生转移的现象。构建克隆载体的一般是非接合型质粒构建克隆载体的一般是非接合型质粒显性质粒显性质粒：能使宿主细胞表现出质粒所携带的性状。 如：隐蔽质粒隐蔽质粒：不会赋予宿主细胞新性状的质粒为隐性质粒。6. 显性质粒和隐蔽质粒显性质粒和隐蔽质粒 抗性质粒（R质粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、抗Ka

7、n（Km)、抗Tet（Tc)等育性质粒（F质粒）降解质粒：降解农药 Ti质粒：形成冠瘿瘤（二）（二） 构建质粒克隆载体的策略构建质粒克隆载体的策略含有有效的质粒复制起始位点（ori）含有外源DNA片段克隆位点含有标记基因载体DNA分子尽可能小特殊需要的元件：强启动子、终止子（三）（三） 质粒载体的构建质粒载体的构建选择合适的出发质粒：ori，选择标记、克隆位点、启动子、终止子正确获得构建质粒载体的元件组装合适的选择标记基因选用合适的启动子构建过程简单1. 质粒载体的构建原则pBR322质粒的结构特征：大小：4363bp 具有ColE1拷贝复制子选择标记：Amp，Tet24种限制性核酸内切酶单一

8、位点 BamHI等导致Tet插入失活 PstI等导致Amp插入失活可以克隆10kb以下以下外源DNA片段2. 大肠杆菌质粒克隆载体大肠杆菌质粒克隆载体pBR322启动子区启动子启动子：Promotor，DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。 Pribnow box5-AGGAGG-3SD序列序列pBR322质粒克隆载体构建：pBR322质粒载体的结构来源质粒载体的结构来源优点：分子量小2个选择标记及若干个插入失活位点高拷贝数Apr缺点：负筛选 pUC质粒载体的结构特点pBR322的复制起点Amp标记大肠杆菌-半乳糖苷酶

9、基因LacZ的启动子、调节因子及编码-肽链的DNA序列LacZ在LacZ的5端有1段多克隆位点（MCS）区段。3. 质粒克隆载体质粒克隆载体pUC18/19pUCpUC质粒载体的优点质粒载体的优点具有更小的分子量和更高的拷贝数pUC18/19的分子量2.69kb具有多克隆位点：多种粘性末端的切点筛选方便：蓝/白菌落pBR322质粒是人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，分子大小为（ 4.3kb），具有松弛型复制子，选择标记为（Amp）和（ Tet ）。就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（复制区： 含有复制起点）；（选择标记： 主要是抗性基因）；（克隆位点

10、： 便于外源DNA的插入）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。载体的功能是（ d ）（a）外源基因进入受体的搭载工具（b）不能为外源基因提供整合能力（c）不能提供复制能力（d）不能为外源基因提供表达能力 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有（ a ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体（a）pSCl01 （b）pBR322（c）pUBll0 （d）pUCl8第七次课结束！4. TA4. TA载体载体TTAA5. 5. 质粒表达载体质粒表达载体表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。lac

11、启动子表达系统启动子表达系统质粒表达载体融合型表达载体非融合型表达载体分泌型表达载体融合蛋白质克隆载体克隆外源基因示意图融合蛋白表达载体：融合蛋白表达载体：融合蛋白：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因转移产生的单一的多肽序列。表达融合体蛋白质策略的优点：（1）克隆的外源基因能有效转译。（2）表达的蛋白质稳定。（3）可以加入信号肽，定位输送蛋白质。（4）利于分离纯化。非融合蛋白表达载体：二、噬菌体克隆载体二、噬菌体克隆载体 DNA： 在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环状DNA分子。 长48kb。 左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。形成cos位点。

12、 包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。相关概念：相关概念：溶菌生命周期：溶菌生命周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入DNA进行复制及蛋白质合成，并组装成子代噬菌体颗粒后，使寄主细胞破裂，释放出来的过程。溶原生命周期：溶原生命周期：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体上，随着染色体的复制而复制的过程。温和噬菌体：温和噬菌体：能进入溶原周期和溶菌周期的噬菌体。烈性噬菌体：烈性噬菌体：具有溶菌生命周期的噬菌体。溶原性细菌：溶原性细菌：带有温和噬菌体的细菌。溶原性噬菌体的生命周期a：噬菌体吸附到寄主细

13、胞表面；b：噬菌体DNA注入寄主细胞；c：噬菌体大量增殖d：子代噬菌体颗粒组装；e：寄主细胞溶菌；f：噬菌体DNA从寄主染色体DNA上删除下来；g：溶原性细胞按照正常速率分裂。1. 1. 与构建载体相关的与构建载体相关的噬菌体性质噬菌体性质基因按功能相近性聚集成簇：基因按功能相近性聚集成簇：左侧区：A-J，合成头尾蛋白的全部基因中间区：J-N，非必要区，与重组有关右侧区：N-R，DNA合成及调控。G+C=10A+T=2cos位点：cohesive-end site 粘性末端位点线性双链DNA分子两端各有1条由12个核苷酸组成的完全互补的5单链突出序列，即粘性末端。注入到寄主细胞内的线性DNA分

14、子会迅速的通过粘性末端之间的互补作用，形成环状双链DNA分子。然后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5P和3OH基团封闭起来，进一步超盘旋化，这种由粘性末端结合形成的双链DNA区域称为cos位点。2. 2. 噬菌体作为噬菌体作为构建克隆载体的依据构建克隆载体的依据噬菌体是一种温和噬菌体能承载比较大的外源DNA片段存在多个限制性位点3. 3. 构建构建噬菌体噬菌体克隆载体的基本策略和路线克隆载体的基本策略和路线用限制酶切去DNA上的非必需区在DNA的非必需区内组入选择性标构建重组DNA分子体外包装系统噬菌体的包装：噬菌体的包装：体外包装体外包装：在离体条件下，用噬菌体或病毒的蛋白质包裹噬菌体或病毒

15、的裸核酸，组装成有感染性的噬菌体或病毒颗粒的过程。DNADNA分子体外包装系统的建立分子体外包装系统的建立E基因基因：噬菌体的E基因编码头部基因的主要成分（占头部总蛋白的70%）D基因基因：噬菌体的D基因也编码头部蛋白，但主要与DNA进入头部和头部的成熟有关（占20%）4.4.噬菌体噬菌体DNADNA的包装限制问题的包装限制问题包装能力： DNA75%DNA 105%， 即从36kb51kb野生型DNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为51kb-28kb=23kb。实际为15kb。若基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。转染作用（transfection）：寄主细胞捕获噬菌

16、体DNA 的过程。或重组噬菌体DNA分子感染并进入大肠杆菌的过程。转导作用（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程。转化作用（transformation）：将质粒等外源DNA引入细胞的过程。5.5.噬菌体克隆载体的应用噬菌体克隆载体的应用构建cDNA文库细菌质粒载体：是以细菌质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，主要用于外源基因片段的转移、贮存、表达以及基因文库的构建等。三、三、CosmidCosmid载体（载体（cos site-carrying plasmidcos site-carrying plasmid）（一）（一） CosmidCosmid载体的特征载体的

17、特征环形双链DNA分子，大小一般在10kb以下具有质粒的性质含有一个cos位点：cohesive-end site 粘性末端位点能承载较大的外源DNA片段一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 克隆能力：3145kbpBR322（6524bp)DNA：cos序列和控制包装序列pBR322质粒的复制子抗药性基因多克隆位点区（二）（二） CosmidCosmid载体的应用程序载体的应用程序应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做柯斯克隆柯斯克隆（cosmid cloning）。克隆进柯斯载体包装进噬菌体感染大肠杆菌选择转化子进行DN

18、A体外包装时，选择E基因突变的噬菌体，能够使溶菌物中积累了大量的（尾部蛋白），而利用D基因突变的噬菌体，产生大量的（头部蛋白），把这两种溶菌物和重组DNA混合起来，将重组DNA包装起来。重组在噬菌体载体上的DNA分子转导大肠杆菌的过程包括：制备包装物，然后进行（体外包装），侵染（ 大肠杆菌 ），并筛选（ 重组体）噬菌斑。柯斯质粒(cosmid)是质粒噬菌体杂合载体，它的复制子来自（质粒）、COS位点序列来自（噬菌体），最大的克隆片段达到（45）kb。噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的（75105 ）的范围内。下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大？

19、（ b ）（a）质粒（b）cosmid（c）噬菌体载体（d）cDNA表达载体（e）pUC质粒第八次课结束！四、蓝藻基因克隆载体四、蓝藻基因克隆载体（一）蓝藻质粒表达载体（一）蓝藻质粒表达载体pPEK2pPEK2的构建的构建出发质粒：蓝藻pPbS和pBR322（二）蓝藻染色体定位整合载体的构建（二）蓝藻染色体定位整合载体的构建第三节第三节 酵母基因克隆载体酵母基因克隆载体1. 2 1. 2 mm质粒质粒2. YEp242. YEp24（酵母游离型质粒）载体（酵母游离型质粒）载体出发质粒：酵母2mm质粒和pBR322ura3基因：尿嘧啶合成缺陷型基因酵母V号染色体上的一个基因，系统命名号为YEL0

20、21W，编码乳清苷5-磷酸脱羧酶，是酵母RNA嘧啶核苷酸合成过程中关键酶。应用方式：应用方式：（2）阴性选择：乳清苷5-磷酸脱羧酶正常（1）阳性选择：乳清苷5-磷酸脱羧酶缺陷 转入ura3基因，培养基中加入尿苷或尿嘧啶，缺陷株生长。5-氟乳清酸 5-氟尿嘧啶， 乳清苷5-磷酸脱羧酶细胞死亡Ti质粒（Tumor inducing plasmid）存在于植物的土壤致癌农杆菌中，诱发植物产生冠瘿瘤的质粒。分为4种类型：一、农杆菌一、农杆菌TiTi质粒载体质粒载体章鱼碱型胭脂碱型琥珀碱型农杆碱型第四节第四节 植物基因克隆载体植物基因克隆载体（一）农杆菌（一）农杆菌TiTi质粒质粒Ti质粒是根癌农杆菌染

21、色体以外的遗传物质双链闭合环型DNA200-250kb结构分为4个功能区： （Vir 区）（Con区）T-DNA区Vir区Con区Ori区（Vir 区）区）（Con区）区）长度25kb，占Ti质粒1/10主要功能是转移DNA，随机插入植物染色体中。 天然的质粒克隆载体。含有2类基因： （1）编码冠瘿碱合成酶（ocs、nos）及分解代谢的基因。 （2）诱发肿瘤基因（Onc）Vir区：激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。占Ti质粒1/3。Con区调控Ti质粒在农杆菌之间的转移，含有与细菌间接合转移的有关基因tra。Ori区复制起始区。（二）农杆菌（二）农杆菌TiTi质粒克隆载体的构建质粒克隆载

22、体的构建取代型取代型TiTi质粒载体的构建质粒载体的构建第五节第五节 动物基因克隆载体动物基因克隆载体一、SV40克隆载体二、逆转录病毒基因载体三、腺病毒基因载体四、豆苗病毒基因载体五、杆状病毒表达载体SV40SV40克隆载体：猿猴空泡病毒克隆载体：猿猴空泡病毒40405243bp一、酵母人工染色体（一、酵母人工染色体（YACYAC）的构建）的构建第六节第六节 人工染色体载体人工染色体载体利用酵母着丝粒载体所构建的大片段DNA克隆。克隆载体上含有着丝粒、端粒、可选择标志基因、自主复制等序列，可携带插入的大片段DNA(1001000 kb)在酵母细胞中有效地复制，如同微小的人工染色体。是基因组研

23、究的有用工具。 TEL：酵母染色体DNA端粒ARS：DNA复制起点CEN：着丝粒应用：构建人类和高等生物的基因组文库选择标记his3：组氨酸合成缺陷型基因Trp1：色氨酸合成缺陷型基因ura3：尿嘧啶合成缺陷型基因sup4：赭石突变抑制基因第二受体克隆子筛选标记第一受体克隆子筛选标记：抗生素 某一突变基因的表型效应由于第二个突变基因的出现而恢复正常时,称后一突变基因为前者的抑制基因。回复突变使突变基因的脱氧核糖核酸(DNA)分子结构恢复正常；抑制基因则并不改变突变基因的DNA分子结构,而只是使突变型的表型恢复正常。抑制基因一般用符号Su代表。无义抑制基因的种类：琥珀型抑制基因：UAG赭石型抑制基因：UAA乳白型抑制基因：UGA、 UAG酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）的应用）的应用酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）的局限性）的局限性构建基因组文库存在插入子的稳定性问题。同一酵母细胞内多个YAC引起交换转化效率低。难以制备纯的YAC-DNA（因结合组蛋白）。二、细菌人工染色体载体（二、细菌人工染色体载体（BACBAC）利用大肠杆菌F质粒或P1噬菌体为基础构建的用于在大肠杆菌中克隆大片段DNA(100350 kb)的载体。用于基因组结构的分析。 特点：带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；载体分子量很小(7.4kb)；选择标