PRRS实验室诊断监测

1、PRRS实验室诊断监测技术实验室诊断监测技术 -RT-PCR检测技术检测技术 黑龙江省动物卫生监督所黑龙江省动物卫生监督所主主 要要 内内 容容 PCR 技术技术 PRRSV RT-PCR 检测技术检测技术动物病毒的组成动物病毒的组成两部分两部分 1. 1. 蛋白质：蛋白质：HA、HI、ELISA 2. 核酸：分为两种核酸：分为两种 脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）-PCR 核糖核酸（核糖核酸（RNA）-RT-PCR PRRS病毒粒子的结构病毒粒子的结构PCR 技术技术概念概念 PCR是一种在体外模拟自然是一种在体外模拟自然DNA复制过复制过程的核酸扩增技术，它以待扩增的两条程的核酸扩增技

2、术，它以待扩增的两条DNA链为链为模板模板，由一对人工合成的寡核，由一对人工合成的寡核苷酸苷酸引物引物介导，通过介导，通过DNA聚合酶聚合酶酶促反酶促反应，快速体外扩增特异应，快速体外扩增特异DNA序列。序列。 19711971年，年，KhoranaKhorana提出：经过提出：经过DNADNA变性，与合适变性，与合适引物杂交，用引物杂交，用DNADNA聚合酶延伸引物，并不断重聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆复该过程便可克隆tRNAtRNA基因。基因。但由于测序和引物合成的困难，对热具有较强但由于测序和引物合成的困难，对热具有较强稳定性的稳定性的DNADNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物

3、聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的 合 成 仍 处 在 手 工 、 半 自 动 合 成 阶 段的 合 成 仍 处 在 手 工 、 半 自 动 合 成 阶 段所以，所以，KhoranaKhorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了PCR的最初设想PCR的实现PCR的改进与完善PCRPCR技术简史技术简史 PCR的最初设想PCR的实现PCR的改进与完善19851985年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的MullisMullis等人发明了聚合酶链反应（等人发明了聚合酶链反应（PCRPCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的

4、DNADNA复制复制最初采用大肠杆菌最初采用大肠杆菌DNADNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR，其缺点是：，其缺点是：KlenowKlenow酶不耐高温，酶不耐高温，9090会变性失活，每次循环会变性失活，每次循环都要重新加。都要重新加。引物链延伸反应在引物链延伸反应在3737下进行，容下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCRPCR产物特产物特异性较差，合成的异性较差，合成的DNADNA片段不均一。片段不均一。 PCRPCR技术简史技术简史 19881988年年Saiki Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌

5、(thermus aquaticus) (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNADNA聚合酶。此聚合酶。此酶具有以下特点：酶具有以下特点：耐高温，在耐高温，在7070下反应下反应2h2h后其残留后其残留活性大于原来的活性大于原来的90%90%，在，在9393下反应下反应2h2h后其残留活性是原后其残留活性是原来的来的60%60%，在，在9595下反应下反应2h2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的40%40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增

6、加大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度了扩增长度(2.0Kb)(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。因而其灵敏性也大大提高。 PCR的最初设想 PCR的实现 PCR的改进与完善基本原理基本原理1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR反应条件 PCR的特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：反应的特异性决定因素为：引物与模板引物与模板DNA特异正确

7、的结合；特异正确的结合； 碱基配对原则；碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。靶基因的特异性与保守性。 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个PFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，24 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，基因诊断 人类基因组工程

8、 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测PRRSV RT-PCR 检测技术检测技术用途 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂盒，用于检测猪血清和组织中的PRRSV，适用于PRRSV 的检测、诊断和流行病学调查。原理 利用离心柱内硅基质膜提取 RNA，在反转录酶的作用下，以RNA 为模板，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA 链。在TaqDNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大一倍。经过35 次循环，最终使扩增DNA 片段放大了数百万倍。将扩增DNA 片

9、段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA 片段的扩增带。反转录 单管一步法 反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。 两步法 反转录和PCR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活和严谨，但是灵敏度不如前者高。自备的器材 仪器：分析天平、离心机、仪器：分析天平、离心机、PCR PCR 扩增仪、扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、组织研磨器、外分析仪）、微波炉、组织研磨器、-20 -20 冰箱、可调移液器（冰箱、可调移液器（2 L2 L、

10、20 L20 L、200 L200 L、1000 L1000 L）。）。样品的制备 1 1 样品采集：病死或扑杀的猪，取肺、扁样品采集：病死或扑杀的猪，取肺、扁桃体和脑等组织；待检活猪，用注射器取桃体和脑等组织；待检活猪，用注射器取血血5 mL5 mL。2 28 8 保存，送实验室检测。（要求送检病料新保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料。）鲜，严禁反复冻融病料。） 2 2 样品处理：每份样品分别处理。样品处理：每份样品分别处理。 2.1 2.1 组织样品处理：称取猪组织组织样品处理：称取猪组织0.05 g 0.05 g 于于研磨器中研磨，加入研磨器中研磨，加入1.5 mL

11、 1.5 mL 生理盐水继续生理盐水继续研磨，待匀浆后转至研磨，待匀浆后转至1.5 mL 1.5 mL 灭菌离心管中，灭菌离心管中，8000 rpm 8000 rpm 离心离心2 min2 min，取上清液，取上清液100 L 100 L 于于1.5 mL 1.5 mL 灭菌离心管中。灭菌离心管中。 2.2 2.2 全血样品处理：待血凝后取血清全血样品处理：待血凝后取血清100 100 LL，置，置1.5 mL 1.5 mL 灭菌离心管中。灭菌离心管中。 2.3 2.3 阳性对照处理：取阳性对照阳性对照处理：取阳性对照100 L100 L，置置1.5 mL 1.5 mL 灭菌离心管中。灭菌离心

12、管中。 2.4 2.4 阴性对照处理：取阴性对照阴性对照处理：取阴性对照100 L100 L，置置1.5 mL 1.5 mL 灭菌离心管中。灭菌离心管中。操作步骤 1 病毒RNA 的提取 1.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600 L，充分颠倒混匀，室温静置35 min。 1.2 将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵 塞吸附柱），13000 rpm 离心30 s，弃去收集管中液体，套上收集管。 1.3 向吸附柱中加入600 L 洗液，13000 rpm 离心30 s，弃去收集管中液体，套上收集管。 1.4 重复步骤1.3。

13、1.5 再空柱13000 rpm 离心2 min。 1.6 将吸附柱移入新的1.5 mL 离心管中，在膜中央加入洗脱液25 L，室温静置1 min，13000 rpm 离 心30 s，获得总RNA。 2 RT-PCR 操作程序 每份总体积 20 L，含16.8 L RT-PCR 反应液（用前混匀），1.2 L 酶混合液，2 L 模板RNA。 例如：n 份样品（n10），配制n+1 份，16.8（n+1）RT-PCR 反应液，再加入1.2（n+1）酶 混合液混匀，取18 L 分装成n 份，分别加入2 L 模板RNA，加入矿物油20 L 覆盖（有热盖的PCR 扩增仪不用加矿物油），作好标记。 在

14、PCR 扩增仪上进行以下程序：42 45 min，94 3 min；扩增条件为94 30 s，55 30 s， 72 30 s，35 个循环；72 延伸7 min。3.电泳 称 3 g 琼脂糖放于500 mL 锥形瓶中，加入50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液200 mL（取4 mL 50 倍 TAE 电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200 mL），于微波炉中熔解，再加入10 L 染色液混匀。在电泳槽 内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR 扩增产物10 L 点样于琼脂糖凝胶孔中，以110120V 电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。结果判定 阳性对照出现436 bp 扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现436 bp 扩增带为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性，否则为阴性。注意事项注意事项 1所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。 2PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺