电镜摄影技术和图像处理-七年制

1、 生物电镜技术生物电镜技术 * *理想的理想的TEM超薄切片：超薄切片：定位准确定位准确厚度要均匀厚度要均匀无刀痕、无颤痕无刀痕、无颤痕无皱褶无皱褶反差适当反差适当无电子染色污染无电子染色污染无漂移现象无漂移现象理想的理想的SEMSEM样品：样品：表面要清洗干净表面要清洗干净镀膜要均匀镀膜要均匀*2、TEM照相程序照相程序选择视野、确定放大倍数（先低后高）。选择视野、确定放大倍数（先低后高）。调整物镜光阑。调整物镜光阑。 要根据样品的反差强弱来调整。要根据样品的反差强弱来调整。聚焦：使用调焦荧光屏，调小电子束聚焦：使用调焦荧光屏，调小电子束 光斑。目的是使图像结构清晰。光斑。目的是使图像结构清

2、晰。 检查电镜图像的稳定性。检查电镜图像的稳定性。 * * 漂移：漂移：指样品结构呈持续、缓慢和单方指样品结构呈持续、缓慢和单方向的移动。可采取定点定结构观察向的移动。可采取定点定结构观察30秒秒,确定有无漂移现象。确定有无漂移现象。 漂移产生的原因漂移产生的原因:样品台有移动样品台有移动支持膜过厚或厚薄不均支持膜过厚或厚薄不均支持膜与载网脱离支持膜破裂支持膜与载网脱离支持膜破裂电子束打在样品边缘样品污染严重电子束打在样品边缘样品污染严重电子束电流过强电子束电流过强.曝光曝光:调节光斑亮度达最佳曝光时间。调节光斑亮度达最佳曝光时间。保存图片保存图片,输入组别输入组别（如使用（如使用CCD相机，

3、调焦、曝光后，以不同图片相机，调焦、曝光后，以不同图片格式将其储存于建立好的文件夹内，刻好光盘后格式将其储存于建立好的文件夹内，刻好光盘后备用）备用）做好观察记录做好观察记录3、电镜摄影的注意事项电镜摄影的注意事项n 严格遵守操作程序。严格遵守操作程序。n 摄影中要避免外界光线的干扰。摄影中要避免外界光线的干扰。n 调焦时光斑亮度要由暗渐亮。调焦时光斑亮度要由暗渐亮。n 选择图像视野。选择图像视野。 一是按一是按先低倍、后高倍先低倍、后高倍的原则选择视野。的原则选择视野。 二是按学术性和艺术性相结合的原则，二是按学术性和艺术性相结合的原则， 布局合理布局合理、重点突出重点突出。n 照相时，要做

4、到照相时，要做到“抓拍抓拍”。要注意防震。要注意防震。n 照相时，照相时， 要做好每个组别和每张照片的记录。要做好每个组别和每张照片的记录。 二、电镜图片的处理和表示方法二、电镜图片的处理和表示方法 * * 1 1、电镜照片上放大倍数的计算方法电镜照片上放大倍数的计算方法 测量测量底片底片上某一结构的尺寸，然后再测量上某一结构的尺寸，然后再测量照照片片上相同结构的尺寸，算出上相同结构的尺寸，算出光学放大倍数光学放大倍数，再乘，再乘以以底片上放大倍数底片上放大倍数就等于照片的总放大倍数。就等于照片的总放大倍数。 例：底片的放大倍数为例：底片的放大倍数为7500，底片上某个颗粒直，底片上某个颗粒直

5、径为径为2mm，冲洗后照片上该颗粒直径为，冲洗后照片上该颗粒直径为2.5mm。 *光学放大倍数光学放大倍数= 2.5mm 2mm = 1.25倍。倍。 *总放大倍数总放大倍数=底片上放大倍数底片上放大倍数光学放大倍数光学放大倍数 = 75001.25=9375倍倍9400倍倍 * * 2 2、电镜照片上放大倍数的表示方法电镜照片上放大倍数的表示方法n按倍数表示：直接用数字表示。按倍数表示：直接用数字表示。9400n按标尺（按标尺（bar）表示：标尺的长度和标尺单位）表示：标尺的长度和标尺单位可根据照片的放大倍数而定。可根据照片的放大倍数而定。 标尺长度标尺长度=放大倍数放大倍数标尺单位标尺单位

6、 (设标尺单位为设标尺单位为1m,标尺长度标尺长度=94001m= 9400m=9.4mm) (设标尺单位为设标尺单位为2m,标尺长度标尺长度=94002m= 18800m=18.8mm) 放大倍数放大倍数=标尺长度标尺长度标尺单位标尺单位 (放大倍数放大倍数= 9.4mm1m = 9400m 1m = 94003 3、电镜、电镜底片扫描底片扫描为照片为照片n打开打开HPHP扫描文件。扫描文件。n点击扫描，在下拉菜单中点击扫描底片。点击扫描，在下拉菜单中点击扫描底片。n点击工具，可以更改分辨率和尺寸，一般选择分辨率点击工具，可以更改分辨率和尺寸，一般选择分辨率600600。n将底片放在将底片放

7、在扫描仪扫描仪平板上，将小的盖板平板上，将小的盖板盖盖在上面。在上面。n然后点击开始新扫描即可。然后点击开始新扫描即可。n选中选中扫描的扫描的图片，将左面菜单第三项改为灰度。调整图片，将左面菜单第三项改为灰度。调整曝光曝光和亮度至适宜为准和亮度至适宜为准。n点击另存为，将扫描好的图片存储在文件夹中。点击另存为，将扫描好的图片存储在文件夹中。一般一般选选JPGJPG或或TIFTIF格式。格式。 * * 4 4、发表文章时对电镜照片的要求发表文章时对电镜照片的要求 一是按上述方法标明放大倍数一是按上述方法标明放大倍数( (标尺一般标尺一般在右下脚在右下脚) )；二是用英文字母或箭头表示某些结构二是

8、用英文字母或箭头表示某些结构 ( (照片下方要有文字说明照片下方要有文字说明) )；三是标明照片的序号三是标明照片的序号( (一般在左下脚一般在左下脚, ,要与要与照片下方的文字说明相一致照片下方的文字说明相一致) )。 为了为了符合发表文章的要求，需要对照片进行一些处理。符合发表文章的要求，需要对照片进行一些处理。可采用可采用PHOTOSHOPPHOTOSHOP软件或其他图像编辑软件进行处理。软件或其他图像编辑软件进行处理。n将将扫描后的图扫描后的图片粘贴到幻灯片中。片粘贴到幻灯片中。n将图片将图片根据自己的需要根据自己的需要按比例放大（点击鼠标右键，按比例放大（点击鼠标右键，选择设置对象格

9、式或直接双击图片，选择尺寸选择设置对象格式或直接双击图片，选择尺寸20,1520,15，锁定纵横比，调整缩放比例）。锁定纵横比，调整缩放比例）。n根据根据底片上底片上标尺的长短，利用自选图形中的长方形制标尺的长短，利用自选图形中的长方形制作一个新标尺作一个新标尺( (下面方框。把标尺大小设为下面方框。把标尺大小设为0.31)0.31)粘贴粘贴在图片的右下角在图片的右下角。n将图片进行剪切（将图片进行剪切（用用工具栏内的图片剪切），双击图工具栏内的图片剪切），双击图片片- -大小大小- -旋转旋转9090度。度。n将将图图片片进行进行编号（利用插入文本框进行编辑）编号（利用插入文本框进行编辑），

10、并，并放放在在图片的图片的左下角。左下角。n如果如果图图片中有需要特殊指示的结构，可加入箭头或其片中有需要特殊指示的结构，可加入箭头或其他标志表示。他标志表示。n将所有因素组合（按将所有因素组合（按CtrlCtrl选中所有标识，右击组合）。选中所有标识，右击组合）。n最最后将该幻灯片另存为后将该幻灯片另存为JPGEJPGE文件交换格式即可。文件交换格式即可。若要把图片放入若要把图片放入WordWord文档文档中进行如下操作：中进行如下操作：n1 1、复制图片到、复制图片到WordWord文档中文档中，A4A4纸每张纸每张6 6张图片时，可张图片时，可双击图片大小变为双击图片大小变为5.69 6

11、.965.69 6.96（可根据自己的需要确（可根据自己的需要确定）定）。n2 2、在在图片图片下方下方进行进行文字文字说明说明，注意要与图片中的指示，注意要与图片中的指示结构相符。结构相符。图9 AD模型组 神经元呈固缩状，细胞周围间隙大；胞质致密，可见脂褐素颗粒（ ）和线粒体肿胀、嵴断裂（ ）bar=2m ；三、三、CCD简介简介 电荷耦合元件电荷耦合元件（Charge-coupled Device,CCD），）， 又称又称CCD图像传感器。图像传感器。 是一种半导体器件，能够把光学影像转化是一种半导体器件，能够把光学影像转化为数字信号，有感光和成像的作用。它具有灵为数字信号，有感光和成像

12、的作用。它具有灵敏度高、抗强光、畸变小、体积小、寿命长和敏度高、抗强光、畸变小、体积小、寿命长和抗震动等优点。抗震动等优点。 CCD的像素（指的像素（指CCD上的感光元件的数上的感光元件的数量）和尺寸是其性能的重要指标。量）和尺寸是其性能的重要指标。 以美国以美国Gatan公司公司 83系列系列CCD相机为例相机为例CCD的安装方式：的安装方式： 1、侧装：在侧装：在35mm口处，从而可以得到大的视口处，从而可以得到大的视野范围，比透射电镜通常用的底片还要大野范围，比透射电镜通常用的底片还要大30%左右，非常适合生物医学样品观察。左右，非常适合生物医学样品观察。 2、底装：得到的视野范围较小，

13、仅有透射电镜、底装：得到的视野范围较小，仅有透射电镜用的底片面积视野范围得用的底片面积视野范围得10%左右，分辨率较左右，分辨率较高，适合材料科学使用。高，适合材料科学使用。Gatan型号型号832.10W CCDn*分辨率：分辨率：4k x 2.7k 即即1100万像素万像素n有效面积：有效面积：36mm x 24mmn*耦合方式：耦合方式：1：1光纤耦合，光纤耦合， 采用采用HCR（高衬度分辨率）技术（高衬度分辨率）技术n*安装位置：侧装，大视野范围安装位置：侧装，大视野范围n读取速度：可达读取速度：可达14幅幅/秒秒n动态范围：动态范围：14位位n制冷模式：半导体制冷制冷模式：半导体制冷

14、n机头保护：机头可伸缩式设计机头保护：机头可伸缩式设计n*基本操作软件：基本操作软件：DigitalMicrograph软件可实现数软件可实现数据的采集、分析、处理等据的采集、分析、处理等n*图像存储模式：图像存储模式：*.dm3图像存储格式，并可与图像存储格式，并可与.tiff格式、格式、.jpg格式、格式、.emf格式、格式、.bmp格式、格式、.gif格式格式等自由转换等自由转换 Gatan型号型号830.10W CCD *1. 耦合方式：耦合方式：1:1光纤耦合，光纤耦合，HCR技术技术2. 安装位置：侧装，大视野范围安装位置：侧装，大视野范围*3. 感应器：感应器：2Kx2K，400

15、万象素万象素4. 抗炫功能：有，可直接拍摄电子衍射抗炫功能：有，可直接拍摄电子衍射5. 闪烁器：高灵敏度多晶磷闪烁器闪烁器：高灵敏度多晶磷闪烁器 6. 动态范围：动态范围：14位位*7. 读取速度：读取速度：30fps，可记录原位动态实验，可记录原位动态实验8. Low-dose低剂量测量低剂量测量9. 当当TEM破真空时，破真空时，CCD机头气动可伸缩机头气动可伸缩10. 冷却方式：半导体制冷冷却方式：半导体制冷+循环冷却水循环冷却水11. 软件：除基本软件：除基本*.jpg, .tiff等存储格式外，还具等存储格式外，还具有有.dm3专用存储格式，专用存储格式，DSV（Digital Vi

16、deo Streaming）数字流媒体软件）数字流媒体软件 CCD相机的耦合方式相机的耦合方式 包括光学透镜耦合和光纤耦合，它是包括光学透镜耦合和光纤耦合，它是CCD的的一个重要技术指标。一个重要技术指标。1、光学透镜耦合：、光学透镜耦合： 是透过两组磁棱镜进行光子信号的传播，其是透过两组磁棱镜进行光子信号的传播，其传输效率只有原有信号的传输效率只有原有信号的1%-10%，传输效，传输效率非常低，其反应灵敏度差，信息容易丢失。率非常低，其反应灵敏度差，信息容易丢失。 使用光学透镜耦合的使用光学透镜耦合的CCD相机获得清晰的生相机获得清晰的生物医学样品图像时，需要加大电子束流，这样物医学样品图像

17、时，需要加大电子束流，这样很容易损坏生物医学样品的原始形貌，破坏样很容易损坏生物医学样品的原始形貌，破坏样品内部信息，所获得的图像反差较差，不能反品内部信息，所获得的图像反差较差，不能反映样品的真实情况。映样品的真实情况。2、光纤耦合：、光纤耦合： 采用光纤进行光子信号的传送，传输效率达采用光纤进行光子信号的传送，传输效率达到原有信号的到原有信号的50%-60%，其传输效率高，其传输效率高，具有高感度，反差较好，能够快速的捕获样品具有高感度，反差较好，能够快速的捕获样品原始形貌信息，非常适合拍摄生物样品。原始形貌信息，非常适合拍摄生物样品。 CCD的特点的特点HCRTM技术技术 光子在传播过程

18、中，由于点扩散函数光子在传播过程中，由于点扩散函数（PSF）的影响，光子信号会发生扩散，所以）的影响，光子信号会发生扩散，所以要保证像素的分辨率，必须保证光子信号的扩要保证像素的分辨率，必须保证光子信号的扩散面积和像素尺寸相匹配，才能达到真实的分散面积和像素尺寸相匹配，才能达到真实的分辨率。假如像素尺寸小于扩散面积就会产生空辨率。假如像素尺寸小于扩散面积就会产生空像素，从而分辨率大大减少。像素，从而分辨率大大减少。 HCRTM技术在保证技术在保证1:1单像素分辨率的同时，单像素分辨率的同时，将闪烁器、光纤及将闪烁器、光纤及CCD感应器一体化感应器一体化(熔接熔接)，从而最大程度上减小了点扩散函

19、数过度效应的从而最大程度上减小了点扩散函数过度效应的产生，减小扩散面积（读取噪音低）产生，减小扩散面积（读取噪音低） ，提高图，提高图像分辨率。像分辨率。Low-dose低计量电子束观测低计量电子束观测 生物样品不能承受强电子束的照射，容易生物样品不能承受强电子束的照射，容易发生相变或者损伤。因此，需要用低剂量的电发生相变或者损伤。因此，需要用低剂量的电子束观察样品时，荧光屏或者电脑屏幕较暗，子束观察样品时，荧光屏或者电脑屏幕较暗，甚至看不到样品的信息。甚至看不到样品的信息。 CCD相机相机具备具备Low-dose低剂量测量的低剂量测量的功能后，能够在低剂量电子束照射时，在电脑功能后，能够在低

20、剂量电子束照射时，在电脑屏幕上得到清晰且明亮的样品图像，从而减少屏幕上得到清晰且明亮的样品图像，从而减少了电子束对于样品的损伤。了电子束对于样品的损伤。 高的图像动态范围高的图像动态范围 图像的动态范围（图像的动态范围（Dynamic Range）决）决定色调真实及柔和。动态范围的差异会在目视定色调真实及柔和。动态范围的差异会在目视上造成很大的差别。例如，上造成很大的差别。例如，1-Bit就是图像点不就是图像点不是黑就是白，是黑就是白，Bit数越高灰阶就越多，影像也会数越高灰阶就越多，影像也会更好更细致。如更好更细致。如 CCD相机具有相机具有14-Bit的动态的动态范围，从而保证能获得高质量的图像。范围，从而保证能获得高质量的图像。 记录原位动态记录原位动态(in-situ)实验结果实验结果 CCD相机具有高的读取速率（相机具有高的读取速率（30幅幅/秒），秒），能够记录原位动态能够记录原位动态(in-situ)实验结果，结合实验结果，结合数字化流动影像软件（数字化流动影像软件（ Digital Streaming Video，DSV ），能够实时记录样品变化情），能够实时记录样品变化情况，并制作多媒体文件，况，并制作多