hplc体内药物分析实用技术

1、体内药物分析实用技术体内药物分析实用技术 色谱法色谱法体内药物分析实用技术体内药物分析实用技术 本课程的主要内容本课程的主要内容123色谱技术的原理色谱技术的原理HPLC在治疗药物检测中的方法学和分离技术在治疗药物检测中的方法学和分离技术 体内药物分析方法应用示例体内药物分析方法应用示例第一节第一节 色谱基础理论色谱基础理论 色谱法色谱法 （Chromatography） 又叫层析法又叫层析法, ,其本质是一种分离分析方法其本质是一种分离分析方法 100多年前俄国植物学家多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的分离植物色素时采用的实验方法实验方法 色谱法色谱法 薄层色谱薄层色谱 将供

2、试品溶液点样于薄层板上，经展开、检视后将供试品溶液点样于薄层板上，经展开、检视后得到的色谱图，与适宜的对照物按同法所得的色谱图得到的色谱图，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用于药品的鉴别或杂质检查作对比，用于药品的鉴别或杂质检查 色谱法色谱法 高效液相色谱高效液相色谱 气相色谱气相色谱 毛细管电色谱毛细管电色谱 色谱法色谱法 色谱法原理色谱法原理 是利用混合物中各组份在不同的两相中是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解溶解, ,分配分配, ,吸附吸附等化学作用性能的差异等化学作用性能的差异, ,当两相作相对运动时当两相作相对运动时, ,使各组分在两使各组分在两相中反复多次受到上述各作用

3、力而达到相互分离相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离 两相中有一相是固定的两相中有一相是固定的,叫作固定相叫作固定相(Stationary Phase),有一相有一相是流动的是流动的,称为流动相称为流动相(Mobile Phase） 相相( (Phase) ): : 物理化学术语物理化学术语, ,特指在某一系统中特指在某一系统中, ,具有相同成分及相同物具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面 色谱法原理色谱法原理 固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进

4、样进样 (Injection)洗脱洗脱 (Elution)相互作用相互作用(Interaction)分离是一个分离是一个物理过程物理过程 色谱法的分类色谱法的分类 按流动相的物态按流动相的物态 气相色谱气相色谱 (Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相用气体作为流动相( (又叫载气又叫载气) ) 适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物液相色谱液相色谱 (Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相用液体作为流动相( (又叫洗脱剂又叫洗脱剂) ) 适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发适

5、合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。 气相色谱应用气相色谱应用 环境领域中多环芳烃（环境领域中多环芳烃（PAHs）的分析（水样品）的分析（水样品） 液相色谱应用液相色谱应用 样品中农药残留的分析样品中农药残留的分析 色谱法的分类色谱法的分类 按分离过程的机理按分离过程的机理 吸附色谱吸附色谱 分配色谱分配色谱 离子交换色谱离子交换色谱 体积排除色谱体积排除色谱 亲和色谱亲和色谱液固吸附色谱液固吸附色谱 气固吸附色谱气固吸附色谱液液分配色谱液液分配色谱 气液分配色谱气液分配色谱各种液相色谱法的比较

6、各种液相色谱法的比较液固吸附色谱液固吸附色谱液液分配色谱液液分配色谱离子色谱离子色谱体积排阻色谱体积排阻色谱亲和色谱亲和色谱固定相固定相 全多孔固体吸全多孔固体吸附剂附剂 固定液载带在固定液载带在固相基体上固相基体上 高效微粒高效微粒离子交换离子交换剂剂 具有不同孔径具有不同孔径的多孔性凝胶的多孔性凝胶 多种不同性多种不同性能的配位体能的配位体键联在固相键联在固相基体上基体上 流动相流动相 不同极性有机不同极性有机溶剂溶剂 不同极性有机不同极性有机溶剂和水溶剂和水 不同不同pH值值的缓冲溶的缓冲溶液液 有机溶剂或一有机溶剂或一定定pH值的缓冲值的缓冲溶液溶液 不同不同pH值值的缓冲溶液，的缓冲

7、溶液，可加入改性可加入改性剂剂 主要应主要应用范围用范围异构体分离、异构体分离、族分离族分离有机化合物有机化合物离子化合离子化合物物大分子量化合大分子量化合物物 、聚合物、聚合物酶、抗体酶、抗体 按分离过程按分离过程液相色谱分离类型选择参考表液相色谱分离类型选择参考表 溶于水溶于水排阻色谱，水为流动相排阻色谱，水为流动相 相对分子质量相对分子质量 2000 不溶于水不溶于水排阻色谱，非水流动相排阻色谱，非水流动相 同系物同系物分配色谱分配色谱 不溶于水不溶于水 异构体异构体吸附色谱吸附色谱样品样品 分子大小差异分子大小差异排阻色谱排阻色谱 反相液反相液液色谱液色谱 相对分子质量相对分子质量 溶

8、于水，不离解溶于水，不离解 2000 排阻色谱，水为流动相排阻色谱，水为流动相 碱碱阳离子交换色谱阳离子交换色谱 溶于水，可离解溶于水，可离解 酸酸阴离子交换色谱阴离子交换色谱 溶于水，溶于水， 离子与非离子离子与非离子反相离子对色谱反相离子对色谱 高效液相色谱法高效液相色谱法 高效液相色谱法高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography，HPLC) 是在经典液相色谱法的基础上，于是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒

9、小而均匀，小颗粒具有高柱色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相高效液相色谱法高效液相色谱法 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 高压：压力可达高压：压力可达150300Kg/cm2 高速：流速为高速：流速为0.1 10.0 mL/min 高效：一根柱中同时分离成份可达高效：一根柱中同时分离成份可达100种种 高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达0.011ng。消耗样品少。消耗样品少高效液相色谱仪高效液相色谱仪 Agilent 1100 HPLC溶剂，流动相溶剂，流动相色谱泵色谱泵自

10、动进样器自动进样器柱温箱及柱温箱及色谱柱色谱柱检测器检测器数据处理系统数据处理系统流动相流动相 泵色色谱谱柱柱检测检测器器 输输液液系统系统分离分离系统系统 检测检测系统系统记录记录系统系统AEGBCDF进样阀进样阀进样进样系统系统 输液系统输液系统(1) (1) 高压输液泵高压输液泵l 主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。l 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性l 输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性 输液系统输液系统(2)梯度淋洗装置梯度

11、淋洗装置l外梯度（高压梯度）外梯度（高压梯度） l内梯度（低压梯度）内梯度（低压梯度） 进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀通常使用耐高压的六通阀进样装置进样装置 分离系统分离系统 分离系统的主要元件是色谱柱，它是色谱分离分离系统的主要元件是色谱柱，它是色谱分离过程中存放固定相的场所过程中存放固定相的场所symmetry C18 5m 4.6 250mm ColumnFLOW液固吸附色液固吸附色谱法谱法 液固吸附色液固吸附色谱谱 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，

12、活性硅胶最常用聚酰胺等固体吸附剂，活性硅胶最常用 选择流动相的基本原则选择流动相的基本原则: :极性大的试样用极性较强的流极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相动相，极性小的则用低极性流动相 吸附色谱是分离吸附色谱是分离几何异构体几何异构体的有效手段；不同的官能的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族族分离化合物分离化合物高效液相色谱的固定相高效液相色谱的固定相液液分配色谱法固定相：液液分配色谱法固定相：固定液固定液载带在载带在固相基体固相基体上上 固相基体固相基体表面多孔型表面多孔型 基体是实心玻璃球，在玻璃球外面

13、覆盖一层多孔活性基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，材料，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，较适合做常规分析，最大允许量受到限制。较适合做常规分析，最大允许量受到限制。 全多孔型全多孔型 由直径为由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（颗粒很细（510 m），孔仍然较浅，传质速率快，易实），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。液液分配色谱法液液分配色谱法 液液分配色谱法的固定液液液分配

14、色谱法的固定液 由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如 ， 氧二丙腈（氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（），聚乙二醇（PEG），），十八烷十八烷（ODS , C18）和角鲨烷固定液等和角鲨烷固定液等化学键合固定相化学键合固定相: : 目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；液液分配色谱法液液分配色谱法 液液色谱法按固定相和流动相的

15、极性不同可分为正相液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法色谱法( (NPC) )和反相色谱法和反相色谱法( (RPC) )。 正相色谱正相色谱：流动相极性：流动相极性固定相极性固定相极性 正相柱也称极性柱正相柱也称极性柱 反相色谱反相色谱：流动相极性：流动相极性固定液极性固定液极性 反相柱也称非极性柱反相柱也称非极性柱 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反 正已烷聚乙二醇正已烷聚乙二醇水、甲醇水、甲醇 C18液相色谱分离模式液相色谱分离模式正相色谱法正相色谱法 采用极性固定相采用极性固定相( (如聚乙二醇、氨基与腈基键合相如聚乙二醇、氨基与腈基

16、键合相) )；流动相为相对非极性的疏水性溶剂流动相为相对非极性的疏水性溶剂( (烷烃类如正已烷、烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间等以调节组分的保留时间 常用于分离常用于分离的化合物的化合物( (如酚类、如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）胺类、羰基类及氨基酸类等） 液相色谱分离模式液相色谱分离模式 反相色谱法反相色谱法 一般用非极性固定相（如一般用非极性固定相（如C18、C8） 流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的

17、有机溶剂以调节保留时间丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间 适用于分离适用于分离的化合物。的化合物。RPC在现代在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用应用的的80%左右左右液相色谱的流动相液相色谱的流动相常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序 ( (最大最大) ) 乙腈乙腈 甲醇甲醇 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醇异丙醇 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 四氯化碳四氯化碳 环己烷环己烷 正己烷正己烷 ( (最小最小) ) 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据在选择溶剂时，溶

18、剂的极性是选择的重要依据液相色谱的流动相液相色谱的流动相 对流动相溶剂的要求对流动相溶剂的要求 粘度小（粘度小（2cp) 沸点低沸点低 纯度高纯度高 价格低廉价格低廉 考虑检测器的通用性考虑检测器的通用性 毒性低，气味小毒性低，气味小 对样品有足够的溶解能力对样品有足够的溶解能力 液相色谱分离模式液相色谱分离模式 离子对色谱离子对色谱 把离子对试剂加入流动相中，被分析的样品离子与把离子对试剂加入流动相中，被分析的样品离子与离子对试剂生成不带荷电的中性离子对，使分配系数增加，离子对试剂生成不带荷电的中性离子对，使分配系数增加，改善分离效果改善分离效果 离子抑制色谱离子抑制色谱 通过调节流动相的通

19、过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的目的 检测系统检测系统 常用的检测器常用的检测器 紫外吸收检测器（紫外吸收检测器（UVD） 示差示差折光检测器（折光检测器（RID） 荧光检测器（荧光检测器（FD） 蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSD） 检测系统检测系统 检测器的性能指标检测器的性能指标 （1）噪声）噪声 （2）基线漂移）基线漂移 （3）灵敏度）灵敏度 （4）线性范围）线性范围 （5）检测器的池体积）检测器的池体积 紫外检测器紫外检测器 原理原理

20、：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率透光率的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型和光二极管阵列三种类型 特点：特点： 灵敏度较高灵敏度较高（10-9g） ，线形范围宽，线形范围宽 流通池可做的很小（流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积，容积8L） 对流动相的流速和温度变化不敏感对流动相的流速和温度变化不敏感 对于紫外吸收检测器，应注意选用检测波长比溶剂的紫对于紫外吸收检测器，应注意选用检测波长比溶剂的紫外截止波长要长外截止波长要长 紫外检测器紫外检

21、测器 紫外检测器的溶剂影响紫外检测器的溶剂影响 不同种类溶剂及溶剂的质量好坏对截止波长有影响不同种类溶剂及溶剂的质量好坏对截止波长有影响 检测波长选择实例检测波长选择实例检测波长通常选择其最大吸收波长检测波长通常选择其最大吸收波长测定波长测定波长 由于很多成分在低波长均具有紫外吸收，故为避免干扰，由于很多成分在低波长均具有紫外吸收，故为避免干扰，通常不宜选低波长做测定波长通常不宜选低波长做测定波长光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示三维立体谱图，如图所示 紫外检测器的

22、重要进展紫外检测器的重要进展 荧光检测器荧光检测器原理原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。或可以与发荧光物质反应衍生化后检测的荧光。或可以与发荧光物质反应衍生化后检测 特点：特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高要比紫外检测法高2 3个数量级（个数量级（10-12g） ，特别适合于药，特别适合于药物和生物化学样品的分析物和生物化学样品的分析荧光检测器荧光检测器不同检测器的灵敏度

23、不同不同检测器的灵敏度不同 示差折光检测器示差折光检测器 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比值。差值与浓度呈正比u 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）u 温度变化要保持在温度变化要保持在0.001、灵敏度低（、灵敏度低（10-6g）、）、 不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器原理原理：通过检测：通过检测光散射光散射程度而测定溶质浓度的检测器。光被散程度而测定溶质浓度的检测器。光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量射的程度取决于溶质颗

24、粒的大小与数量特点特点：通用型检测器，消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，通用型检测器，消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高灵敏度高 适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测不允许使用含不挥发盐组分的流动相不允许使用含不挥发盐组分的流动相 体内药物分析体内药物分析 液相色谱图分析液相色谱图分析HPLC的的图形图形结果结果 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度图，其纵坐标为信号强度,横坐标为时间横坐标为时间色谱峰色谱峰时间时间( (分分) )基

25、线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值色谱图色谱图( (Chromatogram) )液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(1) 色谱图名词术语色谱图名词术语: 死时间死时间(t0):不被固定相滞留的组分不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所从进样到出现峰最大值所需的时间需的时间 保留时间保留时间(tR):组分从进样到出现峰大值所需的时间组分从进样到出现峰大值所需的时间 tR与固定相和流动相的性质、固定相的量、柱温、流速和柱与固定相和流动相的性质、固定相的量、柱温、流速和柱体积有关体积有关调整保留时间调整保留时间 tR= tRt0 色谱参数色谱参数容量因子，容量因子，k 在一定温度下，组分在

26、两相间分配达到平衡时的质量比：在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：0R00Rtttttk容量因子容量因子k越大，保留时间越长越大，保留时间越长 色谱参数色谱参数 k k取决于组分、流动相、固定相的性质及温度取决于组分、流动相、固定相的性质及温度、色谱柱中固定相、流动相色谱柱中固定相、流动相体积体积 色谱参数色谱参数分离因子分离因子（） 表示两个相连组分的分离程度表示两个相连组分的分离程度B)()(AARBRkktt= 1= 1.04.04 1.35 1.50 1.35 1.50 色谱参数色谱参数 与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有

27、关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。温度对分离的影响温度对分离的影响色谱参数色谱参数理论塔板数（理论塔板数（N）单位柱长的塔板数越多单位柱长的塔板数越多表明柱效越高表明柱效越高 色谱参数色谱参数 理论板数（理论板数（N） 计算供试品主成分或内标物质的理论板数。如果测得理计算供试品主成分或内标物质的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件某些条件-药典通常要求不低于药典通常要求不低于3000或或4000h225.54()RtnW色谱参数色谱参数提高柱效的方法（提高柱

28、效的方法（N） 色谱柱本身色谱柱本身减小填料的颗粒度减小填料的颗粒度 找到最佳的流速找到最佳的流速( (根据不同内径根据不同内径) ) 合适的温度合适的温度 降低溶剂的粘度降低溶剂的粘度 增加柱长增加柱长色谱参数色谱参数改变填料颗粒度改变填料颗粒度 色谱参数色谱参数 分离度（分离度（R） 在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定，分离度应大于规定，分离度应大于1.521122()RRttRWW 色谱参数色谱参数不同不同R值的峰重叠情况示

29、意图值的峰重叠情况示意图R =1.0：分离程度：分离程度98%，基本分离基本分离R =1.5：达：达99.7% 完全分离完全分离 R太小，两个峰无法彻底分离太小，两个峰无法彻底分离 R太大，分离时间过长，工作效率低太大，分离时间过长，工作效率低 色谱参数色谱参数)1()1(41)(221R1R2kkNWWttR理论塔板数理论塔板数 分离因子分离因子 容量因子容量因子从数学推导来看，分别增大从数学推导来看，分别增大N, , k值，都可以提高分离度值，都可以提高分离度R色谱参数色谱参数增大柱效增大柱效N,分离因子分离因子 ,容量因子容量因子 k值，都可以提高分离度值，都可以提高分离度R 色谱参数色

30、谱参数不同厂家色谱柱填料质量对色谱柱影响不同厂家色谱柱填料质量对色谱柱影响色谱参数色谱参数 影响分离度的系统因素影响分离度的系统因素 柱内效应柱内效应 柱外效应柱外效应 柱外峰变宽因素柱外峰变宽因素 进样体积进样体积 连接管道连接管道 接头接头 检测器体积检测器体积色谱参数色谱参数 拖尾因子（拖尾因子（T） 考察色谱峰的对称性，保证测量的准确度。特别是采考察色谱峰的对称性，保证测量的准确度。特别是采用峰高法测量时，应检查待测峰的用峰高法测量时，应检查待测峰的T是否符合规定。峰高定是否符合规定。峰高定量时量时T T应在应在0.951.05间，峰面积定量可适当放宽至间，峰面积定量可适当放宽至0.8

31、1.20.0512hWTd色谱参数色谱参数不同作用造成的峰脱尾不同作用造成的峰脱尾1 1 坏柱（烧结片堵塞，柱头塌陷）坏柱（烧结片堵塞，柱头塌陷）2 2 样品超载样品超载3 3 溶剂与样品不相配溶剂与样品不相配4 4 柱外效应柱外效应5 5 强保留基质强保留基质6 6 次保留效应次保留效应7 7 缓冲液不合适缓冲液不合适8 8 假脱尾假脱尾 高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立 建立高效液相色谱方法：建立高效液相色谱方法：选择合适的分析样品的液相色谱方法选择合适的分析样品的液相色谱方法选择合适的柱选择合适的柱选择合适的选择合适的 k 值的条件值的条件确定良好的峰位（确定良好的峰位（值值

32、）选择良好的柱条件（最佳选择良好的柱条件（最佳N值）值）用实测样品解决出现的特殊问题用实测样品解决出现的特殊问题1.1. 证实方法的正确性证实方法的正确性 系统适应性实验系统适应性实验色谱条件举例色谱条件举例色谱柱：色谱柱：Dikma Kromasil C18（250 mm4.6 mm，5 m）流动相：甲醇流动相：甲醇0.4磷酸溶液（磷酸溶液（26 74）检测波长：检测波长：326 nm柱温：柱温：30流速：流速：0.8 mLmin-1进样量：进样量：10 L 系统适应性实验系统适应性实验 系统适应性试验即用各品种项下规定的对照品和条件对系统适应性试验即用各品种项下规定的对照品和条件对色谱系统

33、进行试验，应符合要求。否则可对色谱分离条件作色谱系统进行试验，应符合要求。否则可对色谱分离条件作适当的调整适当的调整。 理论板数理论板数N 柱效柱效 分离度分离度R 分离效果分离效果 拖尾因子拖尾因子T 色谱峰对称性色谱峰对称性 重复性重复性 精密度精密度 分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数 理论板数、分离度、拖尾因子一般工作站均可自动计算理论板数、分离度、拖尾因子一般工作站均可自动计算 HPLC在在TDM中的方法学和分离技术中的方法学和分离技术样品的种类、采集和贮存样品的种类、采集和贮存 血样血样 尿样尿样 唾液唾液样品贮存的

34、条件和贮存稳定性考察样品贮存的条件和贮存稳定性考察全血全血血浆血浆 血清血清生物样品的特点生物样品的特点 样品基质复杂样品基质复杂 浓度低浓度低 浓度变化范围大浓度变化范围大 可供分析的样品有限可供分析的样品有限 样品易变化样品易变化 往往要求快速报告分析结果往往要求快速报告分析结果 测定方法测定方法A :A :空白血浆空白血浆 B :B :模拟血浆样品模拟血浆样品 C:C:血浆样品血浆样品血浆样品的复杂性血浆样品的复杂性 对处理方法要求较高对处理方法要求较高 建立建立生物样品生物样品含量测定方法学含量测定方法学 1. 色谱色谱/ /测定条件选择测定条件选择 检测波长的选择检测波长的选择 色谱

35、柱选择：填料、柱长色谱柱选择：填料、柱长 流动相种类、水相、流动相配比流动相种类、水相、流动相配比 等度洗脱、梯度洗脱等度洗脱、梯度洗脱 柱温选择柱温选择2. 标准品纯度考察标准品纯度考察 采用面积归一化法，应大于采用面积归一化法，应大于9898。含量测定方法学含量测定方法学 验证的效能指标与基本要求验证的效能指标与基本要求 1特异性（专属性）特异性（专属性） 避免干扰避免干扰 2标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围覆盖所有浓度范围 3准确度准确度 与实际状况相符与实际状况相符 4精密度精密度 结果可重现结果可重现 5定量限定量限 达到峰浓度的达到峰浓度的1/101/20 6稳

36、定性稳定性 确保所有样品准确测定确保所有样品准确测定 7提取回收率提取回收率 确保准确度确保准确度含量测定方法学含量测定方法学一、方法特异性一、方法特异性( (专属性或选择性专属性或选择性) ) 1. . 内源性物质的干扰内源性物质的干扰 2. 代谢产物的干扰代谢产物的干扰 3. 联合药物的干扰联合药物的干扰 含量测定方法学含量测定方法学二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围 标准曲线标准曲线 生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性 线性范围线性范围 标准曲线的最高与最低浓度的区间标准曲线的最高与最低浓度的区间 标准曲线用模拟生物样品建立标准曲线用模

37、拟生物样品建立 至少含至少含6 68 8个浓度点个浓度点( (不包括零点不包括零点, ,即空白即空白) ) 可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 含量测定含量测定 校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误有效，高或低于这些点都可能引起计算错误样品浓度样品浓度检测器响应检测器响应含量测定方法学含量测定方法学 外标法外标法 配制一系列已知浓度的标样配制一系列已知浓度的标样储存标样储存标样工作标样工作标样12345增加溶质的浓度增加溶质的浓度含量测定方法学含量测定方法学含量测定方法学含量测定方法

38、学 外标法外标法 测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：按下式计算含量： 峰面积定量峰面积定量 A=a+b C 峰高定量峰高定量 h=a+b C含量测定方法学含量测定方法学外标一点法为常用的定量计算方法外标一点法为常用的定量计算方法XXRRACCA含量测定方法学含量测定方法学内标法内标法 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样配制一系列浓度的标样，其中加有内标样储存标样储存标样工作标样工作标样12345增加溶质的浓度增加溶质的浓度+储存内标样储存内标样内标样浓度不变内标样浓度不变含量测定方法学含量测定方法学 含量测定含量测定

39、内标法内标法 测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：算校正因子：/SSRRACfAC 含量测定含量测定 再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或其杂质）仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：/XXSSACfAC 含量测定含量测定对内标物的要求对内标物的要求 化学结构与待测组分相似化学结构与待测组分相似( (同系物、异构体同系物、异构体) ) 在样品中

40、不存在在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当浓度（响应值）与待测组分相当a)a) 内标色谱峰与其他色谱峰分离好（内标色谱峰与其他色谱峰分离好（R1.5) )含量测定方法学含量测定方法学 三、准确度三、准确度用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度度的接近程度 一般用相对回收率一般用相对回收率( (RR) ) 或或 相对误差相对误差( (RE) )表示表示 应使用实际生物样品测定，分别添加高、中、低三组浓应使用实际生物样

41、品测定，分别添加高、中、低三组浓度对照品度对照品 限度要求限度要求 相对回收率应在相对回收率应在85%115% ( (LOQ附近附近80%120%) RE在在15% ( (LOQ附近为附近为20%)含量测定方法学含量测定方法学 四、精密度四、精密度 系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度 一般用标准偏差一般用标准偏差( (SD)或相对标准偏差或相对标准偏差( (RSD)表示表示 照准确度项下方法，取空白生物基质照准确度项下方法，取空白生物基质( (如血浆如血浆) )数份，数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低分别在同一批内和不同批间制备高

42、、中、低 3 3个浓度的个浓度的QC样品，并分析测定样品，并分析测定限度要求限度要求 一般一般RSD应小于应小于15，在在LLOQ附近附近RSD应小于应小于20 含量测定方法学含量测定方法学 五、定量限五、定量限 定量下限定量下限测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度 LLOQ应能满足测定应能满足测定35个消除半衰期时样品中的药个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出物浓度或能检测出Cmax的的110120时的药物浓度。时的药物浓度。 其准确度应在真实浓度的其准确度应在真实浓度的80%120%范围内，相对标范围内，相对标准差准差( (RSD

43、) )应小于应小于20%。应由至少。应由至少5个标准样品测试结果个标准样品测试结果证明证明 含量测定方法学含量测定方法学六、稳定性六、稳定性 在生物样品的分析中，需要对样品的存放条件和时间在生物样品的分析中，需要对样品的存放条件和时间进行考察，以保证分析结果的准确、可靠进行考察，以保证分析结果的准确、可靠 取高、中、低三个浓度的取高、中、低三个浓度的QC样品，在不同条件下存样品，在不同条件下存放不同时间后，每个样品重复测定三次，平均值应为零时放不同时间后，每个样品重复测定三次，平均值应为零时测定的测定的5以内（经衍生化处理以内（经衍生化处理15以内）以内）含量测定方法学含量测定方法学 七、萃取

44、回收率七、萃取回收率 方法准确度方法准确度( (相对回收率相对回收率) ) 萃取回收率萃取回收率( (绝对回收率）绝对回收率） 萃取回收率与相对回收率的比较萃取回收率与相对回收率的比较 （1 1）萃取回收率主要考察生物样品预处理过程造成的药）萃取回收率主要考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失物的程度损失 （2 2）相对回收率主要用来考察测定方法的准确度，采用）相对回收率主要用来考察测定方法的准确度，采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度含量测定方法学含量测定方法学 萃取回收率萃取回收率 从生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以纯标从生物样本基质中

45、回收得到分析物质的响应值除以纯标准品产生的响应值准品产生的响应值 应考察高、中、低应考察高、中、低3 3个浓度的提取回收率个浓度的提取回收率 限度要求限度要求高、中、低浓度样品的萃取回收率一般应高、中、低浓度样品的萃取回收率一般应50% 高、中浓度的高、中浓度的RSD应应15% 低浓度的低浓度的RSD应应20% 内标法中内标物质的提取回收率应内标法中内标物质的提取回收率应50%生物样品预处理生物样品预处理 1、除蛋白除蛋白： 加入与水混溶的有机溶剂加入与水混溶的有机溶剂 加入中性盐加入中性盐 加入强酸加入强酸 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 酶水解法酶水解法 超滤法超滤法 2

46、、分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集 液液- -液提取液提取 液液- -固提取固提取 3、缀合物的水解缀合物的水解 酸水解法酸水解法 酶水解法酶水解法 4 4、化学衍生化化学衍生化 柱前衍生柱前衍生 、 柱后衍生柱后衍生生物样品的预处理生物样品的预处理 考虑考虑：待测药物的理化性质、生物样品种类、测：待测药物的理化性质、生物样品种类、测 定方法等三方面因素。定方法等三方面因素。 1. 1. 除蛋白除蛋白 （）（）加入与水混溶的有机溶剂加入与水混溶的有机溶剂 常用常用：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等生物样品的预处理生物样品的预处理 （）加入中性盐

47、（）加入中性盐 中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。脱水而沉淀。常用常用：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等及枸橼酸盐等 （）加入强酸（）加入强酸 当当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶盐而沉淀此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶盐而沉淀 常用常用：三氯乙酸、高氯酸、硫酸：三氯乙酸、高氯酸、硫酸- -钨酸混合液、偏磷酸钨酸混合液、偏磷酸 在酸性条件下分解的药物在酸性条件下分解的药

48、物不宜用不宜用本法除蛋白本法除蛋白生物样品的预处理生物样品的预处理 （）加入含锌盐及铜盐的沉淀剂（）加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀 常用常用：硫酸铜：硫酸铜- -钨酸钠钨酸钠 、硫酸锌、硫酸锌- -氢氧化钠氢氧化钠 （）酶解法（）酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法解法 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素，它不仅可使最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素，它不仅可使

49、组织组织酶解，并可使药物析出酶解，并可使药物析出生物样品的预处理生物样品的预处理 （6 6）超滤法）超滤法 以多孔性半透膜以多孔性半透膜- -超滤膜作为分离介质的一种膜分离技超滤膜作为分离介质的一种膜分离技术术 血液中血液中游离药物游离药物的测定可采用分子量截流值在的测定可采用分子量截流值在5 5万左右万左右的超滤膜，用加压过滤法或高速离心法分离的超滤膜，用加压过滤法或高速离心法分离 生物样品的预处理生物样品的预处理2.2.分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集 提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分量组分-药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发

50、使样品得药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集到浓集 具有具有亲脂性亲脂性在适当的在适当的pH值下用值下用溶剂萃取溶剂萃取 蛋白结合较强蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取不宜直接采用溶剂萃取 提取法包括液提取法包括液- -液萃取法和液液萃取法和液- -固萃取法固萃取法生物样品的预处理生物样品的预处理 液液- -液提取法液提取法 基于被测组分在不相混溶的两种溶剂中的分配系数不基于被测组分在不相混溶的两种溶剂中的分配系数不同而得到分离同而得到分离 要考虑所选用有机溶剂的特性（极性、沸点、紫外截要考虑所选用有机溶剂的特性（极性、沸点、紫外截止波长）、有机相和水相的体积及水相的止波长）、有机相和

51、水相的体积及水相的pH等等 生物样品的预处理生物样品的预处理 液液- -固萃取法固萃取法 固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份分离复杂样品中的不同组份 SPE的种类的种类生物样品的预处理生物样品的预处理 固相萃取步骤固相萃取步骤活化活化被分析物被分析物上样上样冲洗冲洗洗脱洗脱杂质杂质 根据根据SPE及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开，让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附开，让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附 生物样品的预处理生物样品的预处理 由于缀合物较原型

52、药物具有较大的极性，不易被有机由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取溶剂提取 为了测定为了测定尿液尿液中药物总量，无论是直接测定或萃取分离中药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，都需要将缀合物中的药物释出之前，都需要将缀合物中的药物释出 有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需较剧烈的方法，常用较剧烈的方法，常用酸水解酸水解或或酶水解酶水解的方法的方法体内药物分析体内药物分析 体内药物分析方法应用示例体内药物分析方法应用示例应用示例应用示例苯妥英钠苯妥英钠C15H11N2NaO2 274.25 常用抗癫痫药物常用抗癫痫药物 有效血药浓度范围有效血药浓度范围( (1020 ug/ ml) )应用示例应用示例 具有环状酰脲的结构，可因互变异构成亚胺醇式，具有环状酰脲的结构，可因互变异构成亚胺醇式，而显酸性，而显酸性，pKa约为约为8.3 本品在水中易溶，在乙醇中溶解，在三氯甲烷或乙本品在水中易溶，在乙醇中溶解，在三氯甲烷或乙醚中几乎不溶醚中几乎不溶应用示例应用示例（1）光谱条件）光谱条件 紫外波长：紫外波长：250 nm 样品处理样品处理 血清加血清加pH 6.8 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.5 mL , ,旋涡混合后加二旋涡混合后加二氯甲烷氯甲烷0.5 mL , ,振荡