11小rna基因技术相关实验3mirna原位杂交

1、【原位杂交 】专业010203目录实验原理实验步骤案例分析1010203目录实验原理实验步骤案例分析201实验方法3123原位杂交简介荧光原位杂交的简介原理详解图01实验方法一、ISH 全称：原位杂交（in situ hybridization） 原理：将标记的核酸探针（miRNA，lncRNA，circRNA，DNA）与细胞或组织中的核酸进行杂交。 实验样本：组织/细胞 研究对象： 组织或细胞 优点：特异性较强、灵敏度较高、快速简便，应用较广。401实验方法二、FISH 全称： Fluorescence in situ hybridization，荧光原位杂交、 作用：检测核酸的表达量。 实

2、验样本：组织/细胞 研究对象： 组织或细胞 优点：特异性强、灵敏度高、快速简便，应用广。501实验方法原理：用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。60103目录实验原理参考范例702实验步骤02实验步骤812实验流程图实验步骤详解二、ISH及FISH实验步骤流程图902 实验流程探针变性标本变性杂交洗脱杂交信号的放大观察结果封片 02 将探针在75 恒温水浴中温育5min，0 510min，使双链DNA探针变性。标本于50 培养箱中烤片23h浸在7075 70甲酰胺的变性液中变性23min。 乙醇脱水，每次5min，

3、然后空气干燥。（2）标本变性（1）探针变性（3）杂交 将已变性或预退火的DNA探针滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上盖玻片，用Parafilm封片，37 杂交过夜（约1517h）。实验步骤 4250 的50甲酰胺中洗涤3次，每次5min。 复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。（4）洗脱（5）杂交信号的放大 加封闭液I、 avidin-FITC，37 温育20min。 4250 的洗脱液中洗涤3次，每次5min。 加封闭液II、antiavidin， 37 温育20min。 PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。 可采

4、用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol，为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。（6）封片（7）荧光显微镜观察FISH结果 先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。1002所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择荧光染料激光波长（nm）发射波长（nm）适用激发光FITC490520IBrhodamine511572IGTexas Red596620IYCy3515570B,BYDAPI345455UPI530615IB,G,IG1102

5、实验步骤观察的方法透射电镜 透射电竟相当于普通显微镜，只是用波长更短的电子束替代了会发生衍射的可见光，从而实现了显微。是二维的图象，会看到表面图象的同时看到内层物质。包括：大型透射电镜、低压透射电镜、冷冻电镜。 扫描电镜是相当与对物体的照相，得到的是表面的。只是表面的立体三维的图象。 因为扫描的原理是“感知”那些物体被电子束攻击后发出的次级电子。扫描电镜分辨率：0.18um可以观察活体细胞组织的动态变化，如：Ca2+、膜电位、PH值、跨膜运输等激光共聚焦显微镜1202激光共聚焦电子显微镜实验步骤1302实验步骤荧光三染CD68-巨噬细胞标志物iNOS-诱导性NOSDAPI-细胞核19SMA-6

6、47Catenin 568 Actin-FITCMerged02实验步骤荧光四染SMA-647 纤维细胞标志物Catenin 568 钙黏蛋白Actin-FITC 细胞骨架DAPI-细胞核200102目录实验原理实验步骤1603案例分析03案例分析1712如何撰写？参考文本1、总起句：说明研究的对象是组织还是细胞，目的是什么？使用试剂盒的一并说明 例：采用FISH技术鉴定LINC01082在结肠癌细胞中的亚细胞定位。按照RiboTM lncRNA FISH Probe Mix(Red) (锐博生物，中国) 说明书操作。2、第二句开始描述具体方法如下：标本的制备及处理：在24孔培养板中放入盖玻片

7、，取细胞按6 104/孔接种，使细胞融合率在80%左右；18如何撰写-原位杂交03案例分析细胞的固定：取出玻片，PBS清洗后加入1mL 4%多聚甲醛室温固定，经蛋白酶K (2g/mL)，甘氨酸，及乙酞化试剂处理杂交：加入250 L预杂交液，42孵育1 h；探针处理：吸除预杂交液，加入250 L含有探针 (300 ng/mL) 的杂交液，42 杂交过夜；洗脱及染色： PBST清洗3次后，加入用PBST稀释的DAPI (1：800) 染液染核，染色5 min；封片：用抗荧光猝灭剂封片，荧光显微镜 (Olympus，Japen) 下选取5个不同视野进行观察并拍照检测 PS: 每一步骤都简约描述，但是

8、该有的的关键点都需要进行体现19如何撰写-原位杂交03案例分析03ISH-参考文本（一） 取组织切片，进行上述脱蜡及水饱和处理。将切片放在杂交炉上，加入取组织切片，进行上述脱蜡及水饱和处理。将切片放在杂交炉上，加入200L的预杂交液的预杂交液，65下预杂交下预杂交1 h。原位杂交滴加终浓度为500ng/mL的LINC01082和miR-17-3p探针杂交液200L (DAKO，USA)，湿盒湿盒55孵育孵育1.5 h，55水浴中振荡洗涤水浴中振荡洗涤25 min，滴加，滴加2-3滴滴NBT/BCIP避避光反应，显色光反应，显色1 h。待染色的信号强度适中时，纯水终止反应；核固红染色。待染色的信

9、号强度适中时，纯水终止反应；核固红染色200l，复染约，复染约1-5 min，在流水下冲洗玻片，在流水下冲洗玻片10 min。按照。按照50%、75%、100醇的顺序脱水处理，每步醇的顺序脱水处理，每步5 min。中性。中性树胶封片，观察取数据。显色剂树胶封片，观察取数据。显色剂 BCIP/NBT 显色为蓝色，复染剂核固红显色为红色。显色为蓝色，复染剂核固红显色为红色。 结果由 2 位病理科医师独立评分，以胞浆蓝染为阳性细胞的判断标准，每张片子在200倍显微镜下随机选取5个视野，观察并计算阳性细胞数的百分比，阴性即阳性细胞5%，阳性即阳性细胞数5%。2003ISH-参考文本（二） 取肝癌及癌旁

10、组织组织切片，进行上述脱蜡及水饱和处理。将切片放在杂交炉上，加入200L的预杂交液，65下预杂交1 h。进入原位杂交滴加终浓度为500ng/mL的MNX1-AS1和miR-152-5p探针杂交液200L (DAKO，USA)，湿盒55孵育1.5 h，55水浴中振荡洗涤25 min，滴加2-3滴NBT/BCIP避光反应，显色1 h。待染色的信号强度适中时，纯水终止反应；核固红染色200l，复染约1-5 min，在流水下冲洗玻片10 min。按照50%、75%、100醇的顺序脱水处理，每步5 min。中性树胶封片，观察取数据。显色剂 BCIP/NBT 显色为蓝色，复染剂核固红显色为红色。 结果由

11、2 位病理科医师独立评分，以胞浆蓝染为阳性细胞的判断标准, 每张片子在200倍显微镜下随机选取5个视野，观察并计算阳性细胞数的百分比，阴性即阳性细胞5%, 阳性即阳性细胞数5%. 21ISH：miRNA，参考PMID: 30233621总起句：说明研究的对象是组织还是细胞，以及如何收集标本的制备及处理：取组织切片，进行上述脱蜡及水饱和处理；杂交：将切片放在杂交炉上，加入200L的预杂交液，65下预杂交1 h探针处理：原位杂交滴加终浓度为500ng/mL的LINC01082和miR-17-3p探针杂交液200L ；洗脱：湿盒55孵育1.5 h，55水浴中振荡洗涤25 min；染色：滴加2-3滴N

12、BT/BCIP避光反应，显色1 h。杂交信号放大：待染色的信号强度适中时，纯水终止反应；复染、脱色：核固红染色200l，复染约1-5 min，在流水下冲洗玻片10 min。按照50%、75%、100醇的顺序脱水处理，每步5 min；封片：中性树胶封片，观察取数据并检测22如何撰写-荧光原位杂交03案例分析03FISH-参考文本（一） 采用FISH技术鉴定LINC01082在结肠癌细胞中的亚细胞定位。按照RiboTM lncRNA FISH Probe Mix(Red) (锐博生物，中国) 说明书操作，具体方法如下：在24孔培养板中放入盖玻片，取细胞按6 104/孔接种，使细胞融合率在80%左右

13、。取出玻片，PBS清洗后加入1mL 4%多聚甲醛室温固定，经蛋白酶K (2g/mL)，甘氨酸，及乙酞化试剂处理后，加入250 L预杂交液，42孵育1 h；吸除预杂交液，加入250 L含有探针 (300 ng/mL) 的杂交液，42 杂交过夜；PBST清洗3次后，加入用PBST稀释的DAPI (1：800) 染液染核，加入到24孔培养板中，染色5 min；PBST清洗3次，每次3 min；用抗荧光猝灭剂封片，荧光显微镜 (Olympus，Japen) 下选取5个不同视野进行观察并拍照。 2303 使用 Fluorescent in Situ Hybridization Kit (C10910，锐

14、博生物，广州) 在MPMCs中原位检测 MNX1-AS1 的表达。将细胞爬片置于24孔板孔底，约5103/孔。实验前大概培养24 h使细胞融合度达到 60%-70%。1PBS 清洗细胞5 min；4%多聚甲醛室温固定10 min。1PBS 洗细胞5 min3；每孔加入1 mL预冷的通透液，4 C静置5 min；弃去通透液后，加入1PBS洗涤细胞5 min3。每孔加入200 L预杂交液，37C封闭30 min；预杂交同时，将杂交液在37C中预热；避光条件下，把 2.5 L 20 M FISH Probe Mix储存液加入到杂交液中；弃去每孔细胞中的预杂交液，加入适量含有LncRNA MNX1-A

15、S1探针的探针杂交液，避光，37C杂交过夜；42C，洗液I清洗每孔细胞3次，每次5 min，以降低背景信号；避光，42C，洗液II清洗细胞1次；避光，42C，洗液III清洗细胞1次；避光，1PBS洗涤细胞，室温5 min。避光，DAPI染色液染色10 min；避光，1PBS洗细胞5 min3。避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂将其固定于载玻片上，进行荧光检测。LncRNA MNX1-AS1的特异性探针由锐博生物合成。 FISH-参考文本（二）2403透射电镜-参考文本 取1 mm 1 mm1 mm组织块，立即放入3%戊二醛 (用0.1 M PBS配制) 溶液中固定34 h；再用0.1 mol/L PBS溶液清洗组织块3次，每次15 min，1%四氧化锇后4固定1 h，0.1 mol/L PBS溶液清洗组织块3次，每次15 min。丙酮逐级脱水，Epon812包埋，半薄切片光学定位后，采用Leica超薄切片机制备超薄切片，片厚60 nm，将切片捞取至300目铜网上。分别取切片和细胞爬片，经醋酸铀及枸橼酸铅双重电子染色，日立H-600型透射电镜观察、摄片、图象分析。